实验步骤 1.
挑取大肠杆菌DH5α的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中,37℃振荡培养12h。
2. 取2ml菌液加入50ml LB液体培养基中,扩大培养约2-3h；测OD600值，当OD600约0.4-0.5
时，停止培养。
3. 菌液放置在冰上30min，无菌条件下倒入50ml Beckman离心管中，4℃，3,500rpm离心
5min。
4. 弃上清，在冰浴上加入8ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L)，轻摇使细胞悬浮。冰上放置
15min。
5. 4℃，3,500rpm离心5min。
6. 弃上清，用1ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L)重新悬浮细胞，200μl/份分装到预冷的无
菌Eppendorf管中，4℃保存备用，在一周内转化率基本不降低；如加入15%的甘油，-70℃保存，可保存一年。
7. 制备的大肠杆菌感受态的活性可通过实验七“质粒的转化”进行验证，转化效率高表明
则表明制备的感受态活性高。 思考题：
在感受态制备过程中，影响感受态活性的主要因素有哪些？ 实际操作过程中通常采取哪些措施避免这些不利影响？
实验七 质粒转化
实验目的
了解细胞转化的概念及其在分子生物学上研究中的意义；学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 实验原理
转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。转化是一个自然存在的过程。细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态。用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细胞进入一个敏感的感受状态，以便外源DNA进入细菌内。
目前，感受态的制备方法很多，如CaCl2法、Hanahan法、超级感受态法和电转化法，相比之下，CaCl2法操作简便，重现性好，转化率一般能达到5×106-2×107转化子/μg质粒DNA，可以满足大多数的实验要求，为人们广泛接受，很多尖端实验室仍然在使用。这项技术始于Mandel和Higa1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短暂热休克后，容易被λ噬菌体DNA感染，随后Cohn于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌，其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体（transformant），即带有异源DNA分子的受体细胞。 实验仪器、材料与试剂 （一）仪器和器皿
1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 恒温水浴锅 4. 恒温箱 5. 微量取液器 6. 高压灭菌锅 7. 玻璃培养皿
（二）材料
1. 实验五所得连接产物
2. 实验六制备的大肠杆菌感受态细胞 （三）试剂
1. LB液体、固体培养基
2. 氨苄青霉素（Amp） 100mg/ml 实验步骤
1. 取适量连接产物加到分装的感受态细胞中，混匀，冰浴30min； 2. 42℃热激90s，迅速在冰浴中冷3-5min；
3. 上述管中加入600μl LB液体培养基,于37℃振荡培养45min-1h；
4. 菌液低速离心（3,500rpm离心2min）倒掉部分上清液，保留约200μl，重悬菌液。 5. 取适量（100μl）菌液涂布LB平板(含Amp 50μg/ml)，室温涂布均匀后（至菌液完全被
吸干），于37℃倒置，过夜培养过夜；
6. 观察菌落，筛选阳性克隆（利用T-载体连接的可利用兰白斑筛选）。
LB平板：
加热融化LB固体培养基，冷却至60℃左右，按50μg/ml加入Amp ，倒入灭菌的培养皿中，每50 ml培养基可倒3个平皿。 思考题：
1、质粒转化的机理？
2、影响转化效果的主要因素有哪些？
实验八、九 质粒（碱法）提取及重组质粒（重组子）的筛选和
酶切检测
实验目的
了解碱法提取质粒的原理，掌握碱法提取质粒的方法。 实验原理
质粒是一种染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA
分子。从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可利用分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常用的有碱变性抽提法，羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法，酸酚法，两相法以及溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法。以上各种方法均有利弊，有的难以控制；有的得率不高；有的手续繁琐；还有的纯度不高。因此在制备质粒DNA时，要考虑三方面的因素，（1）质粒特性：如质粒宿主的菌属，是否需要用溶菌措施；质粒DNA的大小，分子量大的在制备过程中易受损伤，DNA产生缺口；拷贝数，构型，复制型是否需要氯霉素扩增；（2）提取质粒DNA的用量与用途：如用于重组子的鉴定，进行酶切，作探针，测序等；（3）提取方法的成本，程序，重复性，实验室具备的条件等。
碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性而达到分离目的。在碱性条件（pH12.5）下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，但质粒DNA呈超螺旋共价闭合环状，两条互补链不会完全分离，当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时变性的染色体DNA与细胞碎片、不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。
碱裂解法提取质粒DNA的基本原理是溶液Ⅰ使细胞悬浮并且EDTA可以与Ca2 和Mg2 螯和,抑制DNase的活性,溶液II裂解细菌,变性蛋白质和少量质粒,溶液Ⅲ使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀,质粒DNA复性[ 4 ] 。因此如果实验中缺少了溶液Ⅰ,用LB 液体培养基代替之也可以,只要在短时间内完成质粒的提取即可。裂解细菌主要是溶液II中的NaOH, 而不是SDS,所以叫碱裂解法,若只
用SDS也能抽提得到少量质粒,这是因为SDS也是碱性的,但是它只能破坏少量细菌的细胞膜。另外, NaOH若不是新配制的,可能会由于空气中的CO2 与NaOH作用,减弱了其碱性。这一步操作要注意两点:一是,放置时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片段会慢慢断裂[ 5 ] 。二是,混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA。加入溶液Ⅲ后,会有大量的沉淀生成,这是由于要SDS与蛋白质结合后,
SDS与醋酸钾生成了PDS, PDS的溶解度要比SDS低的多,从而使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀了。若用醋酸钠代替醋酸钾,所得到的沉淀就会大大减少
小规模制备质粒DNA的特点是可以一次制备多种质粒，速度快，时间省，步骤简化，DNA纯度好，可以用于酶切，连接，甚至还可做双链DNA序列分析的模板等常规基因工程操作之用。
实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器
1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器 （二） 材料
含质粒的大肠杆菌DH5α。
（三） 试剂
1. LB液体培养基 2. 质粒提取溶液Ⅰ
50 mmol/L 葡萄糖
25 mmol/L Tris-Cl (pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 高压灭菌后，4℃保存备用。 3. 质粒提取溶液Ⅱ(新鲜配制)
0.2mol/L NaOH 1% SDS
4. 质粒提取溶液 Ⅲ（100ml）