思考题：在进行琼脂糖电泳操作过程中，应注意采取哪些保护措施防止溴乙啶污染？
实验四 从琼脂糖凝胶中回收（PCR 产物）DNA片段
实验目的
了解DNA片段回收的原理，掌握用试剂盒回收DNA的方法。 实验原理
本实验所用的回收试剂盒的原理是在NaI存在的条件下，使含有DNA片段的凝胶融化，使DNA片段吸附于硅胶树脂上。最后用TE缓冲液或灭菌水溶出DNA。 实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器
1. 高速台式离心机 2. 微量取液器 （二） 材料
实验二切下的含有回收片段的琼脂糖凝胶
（三） 试剂
除试剂盒所带外，余同实验二。 实验步骤
DNA回收操作流程
1. 样品用琼脂糖凝胶电泳后，将目的DNA片
段切出。
2. 将切下的凝胶块放入1.5 ml的Eppendorf
tube中。
注意：制作琼脂糖凝胶及电泳时，建议使用TAE缓冲液。
3. 向反应管中加入约1.5～3倍凝胶量的NaI
溶液 (通常600 ?l), 55℃加热5～10分钟, 使
凝胶完全融化。
4. 按每20 ?l硅胶树脂结合约1 ?g DNA的比例
加入适量的硅胶树脂后，充分混和，室温放
置20分钟。
注意：在使用硅胶树脂前，一定要将硅胶树脂液充分搅匀。
5. 离心 (5,000×g, 1分钟) 后，除去上清。
注意：此上清液在整个回收过程结束后，确认回收率较高时方可扔掉。如果回收率较低
时，可在此上清液中再次加入硅胶树脂液，重新回收。
6. 在反应管中加入500 ?l洗净用缓冲液, 振荡搅匀后离心 (5,000×g, 1分钟), 除去上清。此操作重复一次。
7. 离心后除净上清液，加入TE缓冲液或灭菌
蒸馏水后搅匀，55℃水浴中放置5分钟。
注意：TE缓冲液或灭菌蒸馏水的添加量为硅胶体积的1倍。
8. 离心 (5,000×g, 1分钟)，回收上清液，此上
清液即为回收的DNA溶液。
注意：再重复一次7. 8. 的操作可提高回收率。
9. 琼脂糖凝胶电泳检测定量回收DNA。
思考题：琼脂糖凝胶中回收DNA产物操作过程中应特别注意哪些操作环节？
实验五 DNA片段的连接（向质粒载体中插入外源DNA）
实验目的
了解DNA片段连接的原理，掌握DNA连接的方法。 实验原理
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
DNA片段之间的连接主要是在DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3'羟基和5'磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来。 实验仪器、材料与试剂 （一）仪器
1. 恒温水浴锅或恒温箱 2. 微量取液器 （二）材料
实验四回收的DNA片段。
（三）试剂
试剂盒所带
实验步骤
1. 含有质粒载体DNA（0.03pmol）及插入片段DNA（0.1～0.3pmol）的DNA溶液（TE
缓冲液或去离子水），总体积为5～10μl。
2. 加入与DNA溶液等量的Solution I（5～10μl）混合均匀，﹛Solution I溶液中含
有连接酶和酶反应缓冲液﹜。
3. 16℃连接反应30min（通常连接过夜效果较好）。 4. 当直接进行转化时，取上述连接反应液10～20μl
*3
*1
*2
转化至100μl的感受态细胞。
*1 如果反应温度升高（>26℃），较难形成环状DNA。因此反应必须于16℃进行。 *2 当连接反应难以进行时，可以适当延长反应时间。当连接效率仍然无所改变时，应
当对DNA进行精制后再反应。
*3 连接反应液可以直接用于转化，如发现转化效率偏低时，反应结束后向反应液中添
加NaCl使其终浓度为500mM，然后进行转化，可改善转化效率。
另外，当转化DNA量较大或者利用电刺激转化时，先用乙醇沉淀法精制DNA。
操作流程图
载体DNA （脱磷酸化） 外源DNA片段（磷酸化） DNA 溶液（5～10??l） 开始反应 ×1 体积 溶液Ⅰ（5～10??l） 转 化
实验六 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）及活性检测
实验目的
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。 实验原理
用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。
实验仪器、材料与试剂 （一）仪器
1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 低温离心机 5. 微量取液器 （二）材料
大肠杆菌DH5α。 （三）试剂
1. LB液体培养基（1升/组） 胰蛋白胨 10 g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml
搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20分钟。 LB固体培养基（1升/组）
在上述LB液体培养基（1升）中加入琼脂粉15g。 2. 0.1mol/L CaCl2溶液，高压蒸汽灭菌。