实验二 反转录PCR（RT-PCR）
实验目的
学习用试剂盒进行反转录PCR的方法。 实验原理
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。
PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为三步：1变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；2退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到~106~7个拷贝。
PCR技术的参数主要有7个：聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、
2+
一价离子。
反转录PCR扩增是指以RNA为模板，经过反转录酶的作用，通过聚合酶链反应（PCR）合成cDNA，并利用基因特定的引物，以合成的cDNA为模板进行PCR反应，从而克隆目的基因或检测特定基因的方法。 实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器
1. PCR仪 2. 台式离心机
3. 琼脂糖凝胶电泳系统 4. 微量移液器 （二） 材料
1． 植物总RNA
2． 上、下游引物（正向引物、反向引物） （三） 试剂
1. TaKaRa的RNA PCR Kit (AMV) Ver.2.1 2. 琼脂糖凝胶电泳所需试剂 实验步骤
1. 反转录反应
反转录反应利用TaKaRa的RNA PCR Kit (AMV) Ver.2.1进行。按下列反应组成调制反转录反应液 (20μl体系)：
MgCl2
10× RNA PCR Buffer RNase Free dH2O dNTP Mixture RNase Inhibitor
AMV Reverse Transcriptase
Specific reverse primer or Oligo dT-Adaptor
4 2 8.5 2 0.5 1 1 1
μl μl μl μl μl μl μl μl
植物总RNA(≤1μg)
按以下程序进行反转录反应：42℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min。 2. PCR扩增：按下列反应组成调制反应液（50μl）：
10× RNA PCR Buffer（含Mg++） 灭菌蒸馏水 TaKaRa Taq 上游引物 下游引物 dNTP Mixtures 模板(反转录产物)
39.5 0.5 1 1 1 1
μl μl μl μl μl μl
5
μl
轻轻混匀后，按以下条件进行PCR反应：预变性94℃ 2 min；变性94℃ 30 sec，退火56℃ 30 sec，延伸72℃ 1.5 min，30个循环；保温72℃ 10 min；4℃保温。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测基因扩增情况。 思考题：简述反转录反应的意义。
实验三 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物（DNA）
实验目的
了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法。 实验原理
琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，也是分离和纯化DNA的常用方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观察，可检测到10ng的DNA）且检测的范围很广。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等)，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭(EB)结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。它的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。 溴化乙锭为一种有毒试剂，使用时一定要戴手套操作，注意防护。 实验仪器、材料与试剂 （二） 仪器
1. 水平式凝胶电泳槽 2. 稳压电泳仪 3. 电炉 4. 紫外检测仪 5. 台式离心机 （三） 材料
实验二中获得的PCR产物 （DNA）。 （四） 试剂 1. 琼脂糖
2. 50×TAE电泳缓冲液贮存液配方：(50×)每升
Tris（M=121.14） 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml
1×缓冲液浓度：0.04mol/L Tris HAc、0.001mol/L EDTA
3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。
1.0g 溴乙锭 100ml 三蒸水
4. 10×DNA样品上样缓冲液 附注：
1.核酸电泳缓冲液
核酸电泳缓冲液有三种，分别是Tris—硼酸(TBE)、Tris—乙酸(TAE)和Tris—磷酸(TPE)。在上述三种缓冲液中：TBE与TPE缓冲液容量高，对DNA的分离效果好，但TPE液中含磷酸盐的浓度偏高，容易使DNA沉淀。TAE液的缓冲容量低，价格较便宜。本实验选用的是TBE缓冲液。缓冲液中的EDTA可螯合正价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR产物被降解。
10倍浓缩的TBE缓冲液配方如下。
Tris 108 g EDTA 9.3 g 硼酸 55 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000 mL，调节pH为8.0～8.2备用，使用时需稀释10倍。
2.影响DNA片段琼脂糖电泳的几个因素：
1. DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。
2. 琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。
琼脂糖凝胶浓度 0.4 0.7 1.0 1.5
可分辨的线性DNA片段大小（kb） 5~60 0.8~10 0.4~6 0.2~4
1.75 2.0 0.2~3 0.1~3 3. DNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。
4. 电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。 实验步骤
1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子，晾干。 2. 插好梳子。
3. 实验所需凝胶的浓度通常为0.8-1%，依据所需配制的凝胶体积,称取一定量的琼脂糖，
放入制胶的容器中（一般用三角瓶），然后加入适量的电泳缓冲液（1×TAE）。 4. 将烧瓶置于电炉上，加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。
5. 关闭电炉，取下三角烧瓶，溶液冷至约60-70℃时(手握烧瓶可以耐受)，在琼脂糖溶液
中加入溴化乙锭至终浓度为0.5μg/ml，轻轻摇匀（避免剧烈摇晃产生气泡），倒入制胶槽内，检查有无气泡。
6. 室温下约10-20分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，
将凝胶放入电泳槽中。
7. 加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1-2mm。
8. 取PCR 获得的DNA样品20μl，加入1/10体积的10×DNA上样缓冲液（10× loading
buffer） ，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底。 9. 用移液器轻轻吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。
10. 插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压（或电流），电泳开始，观察电泳槽中
负极的铂金丝是否有气泡出现。
11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳。 12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。
13. 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml离心管中，放入-20℃冷冻保存，以备以后的实验
用。