一、原理
食品及其原料中蛋白质含量的高低往往为检查其质量的一个重要指标。蛋白质测定常采用微量凯氏定氮法，其原理是将样品与硫酸共同加热消化，使蛋白质分解，其中的氮氧化成氨，氨与硫酸化合成硫酸铵，然后在碱性条件下蒸馏使氨游离，用硼酸吸收，生成四硼酸铵盐，以标准盐酸滴定。凯氏定氮法所测得的为试样品中的总氮量，它除蛋白质的氮外，还包括氨基酸、酰胺、核酸中的氮，换算成的蛋白质称为粗蛋白质。
二、材料、仪器与试剂 （一）材料：各种食品。
（二）仪器：凯氏定氮瓶（100ml）、消化用电炉、容量瓶（100ml）、微量凯氏蒸馏器、
三角瓶（125ml）、滴定管（25ml）、移液管。
（三）试剂：浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、40%氢氧化钠、4%硼酸溶液、0.1mol/L盐酸溶
液。
0.2mol/L盐酸的标定：准确称取0.1g无水碳酸钠（烘干2h）三份，各放入250ml三角瓶中，加50ml蒸馏水溶解，并加入2滴甲基橙指示剂，用0.02mol/L盐酸滴定至橙色。
W
NHCl=——— ×1000 M ——×V 2
式中：W——无水碳酸钠重（g）
M——无水碳酸钠摩尔数 V——消耗盐酸溶液的体积（ml）
溴甲酚绿—甲基红混合指示剂：取0.2%甲基红乙醇（95%）溶液1份和0.2%溴甲酚绿乙醇（95%）溶液5份临用时混合。
三、操作步骤
（一）样品消化：准确称取样品1.0-5.0g（干样0.1-0.3g），置100ml凯氏烧瓶中，干样先加1ml蒸馏水使之湿润，加5ml浓硫酸（比重1.84），摇匀，分两次各加入30% H2O2 2ml，摇匀，待剧烈反应结束后，在消化电炉上加热消化，先用小火加热，待泡沫减少后再将火力加强，至其中固体物消失，成为基本透明溶液，冷却后，再每次加入30% H2O2 2ml，共三次，消化至溶液完全清亮，再煮10min以完全赶走H2O2，冷却后全部转移至100ml容量瓶中，定容，备用。
（二）蒸馏：于100ml三角瓶中加入5.0ml 2%硼酸溶液，并加入数滴溴甲酚绿—甲基红混合指示剂，置于凯氏蒸馏装置的冷凝管下端，使管口浸入硼酸溶液内。煮沸蒸气发生器中的蒸馏水，吸取5-10ml样品消化液注入蒸馏室中，并以20ml蒸馏水洗涤，再加20ml 40%
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氢氧化钠溶液，提起玻璃塞使氢氧化钠流入蒸馏室中，立即将玻璃塞盖紧，并加水于盖处以防止漏气。然后开始蒸馏。待流出液为250ml时，此时氨已全部进入硼酸溶液。停止加热前应先使流出液面离开冷凝管管口，并用少许蒸馏水冲洗管口下端。将三角瓶移开蒸馏设备，准备滴定。
（三）滴定：于上述硼酸溶液中加入2滴溴甲酚绿—甲基红指示剂，用0.02mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色后，再加1-2滴盐酸溶液使之呈红色为止。然后按下列公式，根据消耗的酸量即可计算出样品中蛋白质含量。 四、计算
1
粗蛋白质%=（V1-V2）×N×0.014×——×100×6.25 W
式中：V1——样品滴定时消耗0.02mol/L盐酸量（ml）
V2——试剂空白滴定时消耗0.02mol/L盐酸量（ml） N——盐酸溶液的摩尔浓度 W——样品重（g） 0.014——氮的毫摩尔 6.25——氮与蛋白质的换算系数
实验二十 可溶性蛋白质的测定（考马斯亮蓝G-250
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法）
一、原理
考马斯亮蓝G-250以两种不同颜色存在即红色与蓝色，当染色剂与蛋白质结合时，红色就转变为蓝色。这种蛋白质染色剂复合物有较高的消光系数。因此，用这种方法测定蛋白质含量灵敏度比较高，染色剂和蛋白质的结合过程迅速，大约2min，而且蛋白质—染色剂复合物能在溶液中保持稳定1h之久。
二、材料、仪器与试剂
（一）材料：绿豆芽、马铃薯。
（二）仪器：分光光度计，分析天平，容量瓶、移液管、具塞刻度试管。 （三）试剂
1．考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%正磷酸100ml，最后加蒸馏水至1000ml，此溶液可在常温下放置一个月。 2．蛋白质标准液：称取100mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸馏水中，制成100μg/ml贮备液。再按下表比例配制成每毫升分别含200,400,600,800,1000μg蛋白标准液及每毫升分别含20,40,60,80,100μg蛋白的标准液。
表1
蛋白浓度（μg/ml） 加贮备液（ml） 加蒸馏水（ml）
表2 蛋白浓度（μg/ml） 加贮备液（ml） 加蒸馏水（ml）
三、操作步骤
（一）标准曲线的制作
1．100~1000μg/ml蛋白标准曲线：准确吸取含有200，400，600，800，1000μg的牛血清蛋白标准液0.1ml, 分别放入10ml刻度试管中，加入5.0ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，将溶液混匀，2min后在595nm处测其消光值，空白以蒸馏水代替标准液，其它操作同上。
2．0~100μg/ml蛋白标准曲线：准确吸取0.5ml含20,40,60,80,100μg牛血清蛋白标准液，分别放入10ml具塞刻度试管中，加入5.0ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，其它操作同上。以消光值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，作标准曲线。
（二）样品中蛋白质浓度的测定：样品中蛋白质浓度的测定除加入标准溶液作为样品液外，其余操作完全相同，通过标准曲线即可查得每毫升溶液中蛋白质的含量。
20 0.2 9.8
40 0.4 9.6
60 0.6 9.4
80 0.8 9.2
100 1.0 9.0
200 0.4 1.6
400 0.8 1.2
600 1.2 0.8
800 1.6 0.4
1000 2.0 0
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实验二十一 茚三酮法测定氨基酸总量
一、原理
氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。反应式如下；
该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。
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二、主要仪器
分光光度计
三、试剂
1. 2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35ml热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2·H2O）,搅拌过滤（作防腐剂）。滤液置冷暗处过夜，加水至50ml，摇匀备用。
2. pH8.04磷酸缓冲溶液：准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4） 4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500ml容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。
准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500ml容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。
取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0ml与190ml磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。
3. 氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100ml容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。准确吸取此液10.0ml于100ml容量瓶中，加水至标线，摇匀。此为200μg/ml氨基酸标准溶液。
四、操作方法
1. 标准曲线绘制
准确吸取200μg/ml的氨基酸标准溶液0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml（相当于0，100，200，300，400，500，600μg氨基酸），分别置于25ml容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0ml，然后加入茚三酮和磷酸缓冲溶液各1ml，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，在5570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
2.样品的测定
吸取澄清的样品溶液1-4ml，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，用测得的A值在标准曲线上即可查得对应的氨基酸微克数。
五、结果计算
C
氨基酸含量（μg/100g）=——————×100 m×1000
式中 c——从标准曲线上查得的氨基酸的μg数；
m——测定的样品溶液相当于样品的质量，g。
六、说明及注意事项
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