实验一 缓冲溶液的配制和氨基酸两性性质测定
一、目的要求
1．了解缓冲溶液的作用原理及缓冲原理，学习缓冲溶液的设计、配制及酸度计的使用方法。 2．观察甘氨酸的两性性质和缓冲作用。
二、实验原理
能抵抗一定量酸或碱的影响，而保持溶液pH值基本不变的溶液称为缓冲液。缓冲液一般是由弱酸或弱碱与它的盐组成。如乙酸和乙酸钠组成乙酸缓冲液、硼酸和硼砂组成硼酸缓冲液等。缓冲液可分为一般缓冲液(或通用缓冲液)和标准缓冲液两类。标准缓冲液pH值是一定的(与温度有关)，叫做pH标准液，当用酸度计测量溶液的pH值时，就要用pH标准液来校正仪器。一般缓冲液的pH值可用下式计算：
式中的Ca、Cb、Cs分别为弱酸、弱碱、盐的浓度(mol/L)；Ka、Kb分别为弱酸、弱碱的电离常数；Kw为水的离子积。当温度一定时，pKa(或pKb)为一常数，因此缓冲液pH值就随着盐和酸(或碱)的浓度比值而变化。如果制备缓冲液时所用的盐和酸的浓度相同，则配制时所取盐和酸的溶液的体积比就等于它们的浓度比，故上式可写为：
可见只要按盐和酸溶液的毫升数的不同比值配制就可得到不同pH值的缓冲液。如加水稀释，其盐和酸的浓度都以相同比例降低，比值不变，因此适量稀释不影响缓冲液的pH值。 缓冲液能抵抗一定量酸或碱的作用称缓冲作用，缓冲作用的大小称为缓冲能力或缓冲容量(β)，可定义为每升缓冲液改变一单位pH值所需加入强碱或强酸的量(摩尔数)。
一种特殊的酸和它相配对的碱在它们浓度相等(即pH值等于酸的pKa)时，缓冲能力最大。缓冲能力除与其共轭酸碱对的比率有关外，还与总浓度有关，总浓度越大，缓冲能力越强，一般缓冲液浓度在0.05～0.20mol/L，pH=pKa±1的范围内具有满意的缓冲能力。
α－氨基酸是一类两性物质；既可以和酸作用，又可以和碱作用，对酸、碱的加入具有一定的缓冲能力；通过甘氨酸的酸、碱滴定及测量不同浓度的酸、碱条件下甘氨酸溶液的pH值，绘出—条滴定曲线，从中可以看到这种变化。
三、仪器及器材
酸度计，碱式滴定管，移液管，三角瓶，容量瓶，烧杯
四、试剂
1．0.1 mol/L，0.01mol/L NaOH 2．0.1mol／L，0.01 mol/L HCl 3．0.1%溴麝香草酚蓝溶液 4．Na2HPO4·2H2O (化学纯) 5．KH2HPO4 (化学纯) 6．0.1 mol/L甘氨酸溶液
五、操作方法
1．磷酸缓冲液的配制及pH值的测定： （1）母液的配制：
A液（0.1mol/L KH2PO4）：称量1.36g KH2PO4定溶100mL。 B液（0.1mol/L Na2HPO4 ）：称量3.58g Na2HPO4定溶100mL。
（2）不同pH值的磷酸缓冲液的配制：取三个50mL的三角瓶，编号，按表1-1操作：
表1-1 磷酸缓冲液pH值的测定
试剂（mL） 0.1mol/L KH2PO4 0.1mol/L Na2HPO4 pH 计测定结果 计算结果
三角瓶号
1 2 3
24 15 6 6 15 24
混匀后用酸度计测定三种缓冲液的pH值，并填入表1。
2．稀释对缓冲液pH值的影响：取2个三角瓶，编号，按表1-2操作；
表1-2 稀释对缓冲液pH值的影响
试剂（mL） 0.1mol/L KH2PO4 0.1mol/L Na2HPO4
蒸馏水
指示剂显色（3滴） pH 计测定结果
三角瓶号
4 5 15 7.5 15 7.5 0 15 淡蓝 淡蓝
混匀后分别在各管中加入3滴麝香草酚蓝指示剂，比较试管溶液的颜色，并用酸度汁测定4、5号三角瓶中的pH值，填入表2。
3．不同浓度的缓冲液缓冲能力的测定：取2个三角瓶，编号，按表1-3操作；
表1-3 不同浓度的缓冲液缓冲能力的测定
试剂（mL） 0.1mol/L KH2PO4 0.1mol/L Na2HPO4
蒸馏水
三角瓶号
6 7 0.6 6 2.4 24 27 0
总浓度
指示剂显色（3滴） pH计测定结果 用HCl滴定(刚变色)
消耗的量 pH计测定结果 计算结果
0.01mol/L 0.1mol/L 浅蓝 浅蓝
(用0.01 mol/L HCl滴定) (用0.1 mol/L HCl滴定)
测定滴定前和滴定后6、7号三角瓶中的pH值，并填入表3。 4．测定甘氨酸的滴定曲线
取50mL三角瓶15个，编号，按表1-4数据加入试剂，充分摇匀后分别测定pH值。
表1-4 甘氨酸的滴定曲线的测定 0.1mol/L甘氨酸溶液（mL） 0.1mol／L HCl（mL） 0.1 mol/L NaOH（mL） 蒸馏水（mL） pH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
0.0 0.5 1.0 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0 － － － － － － －
－ － － － － － － － 0.5 1.0 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0
15.0
14.5
14.0
13.0
12.5
12.0
11.0
10.0
14.5
14.0
13.0
12.5
12.0
11.0
10.0
六、数据处理及结果分析
1. 缓冲液pH值的计算：
按下列公式计算三角瓶1、2、3中溶液的pH值(KH2PO4的pKa=6.81)，并填入表1。 pH=pKa+lgKs/Ka 2. 缓冲能力的计算
按公式计算三角瓶6、7中的缓冲能力的大小，并填入表3。 β＝db/d(pH)
3. 绘制甘氨酸的酸碱滴定曲线：
以表四测定的pH值为纵坐标，以HCl、NaOH的毫升数为横坐标，绘制甘氨酸的酸碱滴定曲线。
七、注意事项
1．缓冲液的pH值必须准确。
2．了解pH计的正确使用方法，注意电极的保护。
八、思考题
1．试述缓冲液的作用及决定缓冲能力大小的因素。
2．在实际应用中应如何正确选用和配制符合要求的缓冲液？
3．在甘氨酸的酸碱滴定曲线上，哪些部分代表缓冲区域？何处为等电点？
九、参考文献
1．陈雅蕙 等编.生物化学实验原理和方法（第2版），北京大学出版社，2005，p449-457 2．陈毓茎 主编.生物化学实验方法和技术（第1版），科学出版社，2002，p217-227
附：常见缓冲液及其优缺点： 1. 磷酸盐缓冲液
磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂, 由于它们是二级解离, 有 2个pKa 值, 所以用它们配制的缓冲液, pH 范围最宽：
NaH2P04：pKa1=2.12, pKa2=7.21 Na2HP04：pKa2=7.21, pKa3=12.32
配酸性缓冲液：用 NaH2P04, pH 值为 1~4 。配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐, pH 值为 6~8。配碱性缓冲液：用 Na2HP04, pH 值为 10~12 。
磷酸盐缓冲液的优点为：
① 容易配制成各种浓度的缓冲液; ②适用的 pH 范围宽; ③pH 受温度的影响小;④缓冲液稀释后 pH 变化小, 如稀释 10 倍后 pH 的变化小于 0.1 。 其缺点为：
①易与常见Ca2+、Mg2+以及重金属离子缔合生成沉淀; ②会抑制某些生物化学过程, 如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 2.Tris缓冲液( 三羟甲基氨基甲烷)
Tris 缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多, 有超过磷酸盐缓冲液的趋势, 如在SDS- 聚丙烯酷胶凝胶电泳中己都使用 Tris 缓冲液, 而很少再用磷酸盐。
Tris 缓冲液的常用有效 pH 范围是在“中性”范围 , 例如 Tris-HCl 缓冲液pH 值为 7.5~8.5，Tris- 磷酸盐缓冲液 pH 值为 5.0~9.0。
Tris-HCl 缓冲液的优点是：
① 因为 Tris 碱的碱性较强 , 所以可以只用这一种缓冲体系, 配制 pH 范围由酸性到碱性的大范围 pH 值的缓冲液;
② 对生物化学过程干扰很小, 不与钙离子及重金属离子发生沉淀。
其缺点是：
①缓冲液的 pH 值受溶液浓度影响较大, 缓冲液稀释10倍, pH 值的变化大于0.1;
②温度效应大, 温度变化对缓冲液 pH 值的影响很大, 例如 4℃时缓冲液的 pH 值为 8.4, 则 37 ℃时的 pH 值为 7.4, 所以一定要在使用温度下进行配制, 室温下配制的 Tris-HCl 缓冲液不能用于0~4℃;
③易吸收空气中的CO2, 所以配制的缓冲液要盖严密封;
④此缓冲液对某些 pH电极发生一定的干扰作用, 所以要使用Tris 溶液具有兼容性的电极。 3. 硼酸盐缓冲液
常用的有效 pH 范围是：pH 值为 8.5~10.0, 因而它是碱性范围内最常用的缓冲液, 其优点是配制方便, 只使用一种试剂, 缺点是能与很多代谢产物形成络合物, 尤其是能与糖类
的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。 4. 氨基酸缓冲液
此缓冲液使用的范围宽, 可用于 pH 值为 2.0~11.0, 例如最常用的有：甘氨酸 -HCl 缓冲液：pH 值为 2.0~5.0 ；甘氨酸 -NaOH 缓冲液：pH 值为 8.0~11.0 ；甘氨酸 -Tris 缓冲液：pH 值为 8.0~11.0(此缓冲液用于广泛使用的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液) 。组氨酸缓冲液：pH 值为 5.5~6.5 。甘氨酰胺(glycine amide) 缓冲液：pH 值为 7.8~8.8 。甘氨酰甘氨酸 (glycylglycine 〉缓冲液：pH 值为 8.0~9.0 。
此类缓冲体系的优点是：为细胞组分和各种提取液提供更接近的天然环境。
其缺点是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似, 也会干扰某些生物化学反应过程, 如代谢过程等; ②试剂的价格较高。
实验二 分光光度计线性分辨范围测定
一、目的要求
掌握比色法的用途、原理、测定分光光度计线性范围的方法及重要性。
二、实验原理
比色法是常用的生化分析方法。仪器简单，价格便宜，操作方便。有分光光度计的实验室，可以很方便地完成多种生物物质的定量分析。比色法的理论基础是朗伯—比尔吸收定律，它的使用要求在分光光度计线性分辨范围之内，否则将使结果出现较大的误差，这一点恰恰是容易被忽视的。通过对一台分光光度计线性分辨范围的测定，加深对比色法的理解，对今后的科学研究也将是十分有益的。
在用紫外—可见分光光度计进行某种物质溶液的吸收光谱测定之前，先将光源灯发射的连续光谱分光获得一定波长的单色光，然后测定单色光透过溶液的吸光度，所以比色法也称为分光光度法。各种不同的物质具有其各自的吸收光谱，因此当某种光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能减弱的程度和光经过的物质的厚度及物质的浓度有一定的比例关系。
A= lgI0/I =lg1/T=εbC
式中I0为入射光强度，I为透射光强度，b为溶液厚度，C为溶液浓度，T为透光度，T＝I / I，A为吸光度，ε为摩尔吸收系数。如果溶液浓度以mol／L表示，溶液厚度以cm表示，ε单位为L／(mol·cm)。ε愈大，表示溶液对单色光的吸收能力愈强，分光光度测定的灵敏度就愈高。
这就是在分光光度测定中常用的朗伯—比尔定律。该定律表示入射光通过溶液时，吸光度与该溶液的浓度和厚度的关系。
根据朗伯—比尔定律，吸光度与溶液浓度应是通过原点的线性关系(溶液厚度一定)，但在实际工作中吸光度与溶液浓度之间常常偏离线性关系，产生偏离的主要因素有：
1．样品溶液因素。朗伯—比尔定律通常只在稀溶液时才能成立，这是由于随着溶液浓度增大，吸光质点间距缩小，彼此间相互影响和相互作用加强，破坏了吸光度与浓度之间的线性关系。
2．仪器因素。朗伯—比尔定律只适用于单色光，但经仪器狭缝投射到被测溶液的光，并不能保证理论要求的单色光，这也是造成偏离朗伯—比尔定律的一个重要因素。