超过5V/cm（大电泳槽不超过200V ,小电泳槽不超过150V)。
8.电泳时间看实验的具体要求而异。在电泳中途可用紫外灯直接观察，DNA各条区带分开后，电泳结束。一般20分钟～3小时，取电泳凝胶块直接在紫外灯下拍照或绘图。
六、注意事项
（一）、水平式琼脂糖凝胶电泳的操作并不复杂也不困难，但影响DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于DNA分子大小与构型外，还有琼脂糖凝胶的浓度，电压大小，缓冲液pH值和电泳时的温度等。为了精确测定其分子量的大小，可以采用以下措施：
1.每次测定时，要有已知分子量的DNA片段作为标准，进行对照电泳。 2.选择最合适的电泳条件
(1)在低电压时，线状DNA片段的迁移速度与电压成正比，当电场强度（单位长度的电
压）提高时，大分子量DNA片段的迁移速度就不再与电压成正比，所以电压一般不超过每厘
米5伏。
（2）缓冲液中的pH值离子度：电泳液都采用缓冲液，常用的电泳缓冲液有TAE，TPE,TBE 3种,以保证较稳定的pH值,pH值的剧烈变化会影响DNA分子所带的电荷，因而也影响正常的电泳速度。而在长时间的电泳过程中，在电泳槽两端的离子强度差异很大，因而要能相互勾通，保持离子强度的一致。琼脂糖凝胶电泳要求的电泳缓冲液容量较低，因此3种电泳缓冲液中常用TAE缓冲液，TAE缓冲容量较低，且较便宜，DNA分子迁移速度较快，分辨效果好。电泳缓冲液作为一般的鉴定可以反复使用，但要注意补充水分，如果作为分离片断用，要换新鲜的缓冲液。
(3）电泳的温度：温度对电泳的影响不太严格，一般在0℃～30℃之间就可以了。但是如果夏天的室温超过37℃时，可将电泳槽放在冰库、冰柜或有空调的房问内。我们为了实验的方便都不采用电泳槽的冷却循环系统，尤其是教学实验，它需要较多数量的电泳槽，更需要考虑大量电泳槽的造价间题。当琼脂糖凝胶浓度低于0.5％或低熔点琼脂糖凝胶电泳时，电泳温度不宜太高，一般在低温室进行。
3.提高分子筛效应，降低电荷效应
DNA分子在电泳槽内，从负极向正极移动，是DNA分子大小与所带电荷多少两者决定的。我们的目的是测定分子量的大小，所以应当尽量减少电荷效应。在大孔径的琼脂糖凝
胶中（即琼脂糖含量低的凝胶中），凝胶对不同大小的DNA分子，其阻滞程度差异不大，而DNA分子的迁移率更多地依赖于分子的净电荷，因此对较小的DNA分子群得不到很好的分离效果。如果增加琼脂糖凝胶的浓度，可在一定的程度上降低电荷效应，使DNA分子迁移速度的差异主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定。但是高浓度的琼脂糖凝胶电泳，会花费很长时间，对教学的安排带来困难，因此通常根据待测分子量范围选择合适浓度的凝胶。同时也要根据每次电泳的不同要求，选择不同大小的电泳槽与合适的条件。当我们在提取质粒DNA时，要检测某些弃去液中是否有残留的DNA，就可用较低浓度的琼脂糖凝胶，加大电压，可及时得到结果。如果是测定重组DNA的分子量，那就要用较高浓度的琼脂糖凝胶，把电压开得很低，就可让电泳走过夜。
（二）初学者进行琼脂糖凝胶电泳时，估计DNA的点样量是比较困难的，点样量多了，电泳结果很不理想，点样量少了，就得不到结果。点样量包括2个方面：一是DNA在电泳条带上的浓度，太高易产生拖尾与弥散现象，点样量太少，分辨不清，影响结果；另一方面是点量体积太大，点样孔装不下，太小分布不均。因此常常采用不同浓度的点样量，同时进行几个样品电泳。实践多了，有了经验，就不必重复，也节省了DNA样品。
DNA点样量的多少与分子的酶切片段多少有关，此外，还与DNA的纯度与鉴别方法有关。一般来说，0.1μgDNA的用量，已足够肉眼观察，现将pBR322质粒DNA (6.Okb)取不同点样量的电泳区带的亮度图示如下：(见图10-2)
图10-2
点样操作的好坏与电泳关系密切，最重要的是在点祥之前将样品预先混合均匀，
如果DNA浓度较大，只需吸1μL。那就必须加水或电泳缓冲液把它稀释至10μL以上，再加1/5溴酚蓝指示剂混合均匀后点样。
点样量的体积大小都在15μL左右，最高也不超过40μL（制备电泳例外）。 （三）溴化乙锭(EB)染色
溴化乙锭是核酸的显色剂，上述实验都已介绍溴化乙锭能插入DNA，可用它检测DNA的含量。
在水平式琼脂糖凝胶电泳中，目前国内外实验室使用溴化乙锭对DNA的染色，一般有3种做法：
(1)在制胶中与电泳缓冲液中同时加入0.5μg/ml的溴化乙锭。
(2)只在胶中加入0.5μg/ml的溴化乙锭，而在电泳缓冲中不加溴化乙锭。这就减少操作时双手受溴化乙锭污染的可能，而且DNA区带也清晰可见。这是目前绝大多数实验室最常用的方法。但在电泳时. EB也同时会回负电极方向移动，速率与溴酚蓝一致，这样，当DNA样品迁移到胶的一半时，EB染色效果要下降。
(3)在电泳结束以后，取出琼脂凝胶，放在含有0.5μg/ml溴化乙锭的电泳缓冲液（或dH2O)中染色10～30分钟，如果天气寒冷，琼脂搪凝胶浓度高，凝胶板厚也可在37℃保温或轻微摇动染色，也有人加大溴化乙锭的剂量（lμg/ml)或延长染色时间。
一般来讲，应按照实验的不同要求进行不同的染色，采用（1）与(2)可在实验过程中随时观察DNA的迁移情况，极为方便。(1)适合于分离和检测分子片断较多，DNA条带迁移距离差别较大电泳时间较长的DNA电泳，因为溴化乙锭的迁移方向与DNA的迁移方向相反，从正极向负极移动，电泳时间长了，靠正极方向的胶上的EB浓度明显比靠负极端的低，而且靠正极端的DNA片段分子量也较小，这样在紫外灯下观察造成误差，如果缓冲液中有EB补充，就克服了这个问题。但由于缓冲液中有EB所以操作更需小心谨滇，防止实验用具及台面的EB污染，尤其经常检查双手（虽已戴手套）是否有污染（这很方便，在暗房中将双手放在紫外灯下快速检查一遍，出现有亮点的地方就是EB溅染点，用肥皂与水清洗干净，EB废液必须收集于特定的危险品回收桶中。（2)染色法用得最多，适用于DNA片段少，电泳时问短的DNA电泳。(3)的优点是适合于更准确地测定DNA的分子量EB与DNA结合会影响DNA的电泳行为，与样品中存在大量RNA的DNA凝胶电泳。但也同(1)样，要注意EB的污染。
（四）溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用是电泳的上样缓冲液，50％的蔗糖，是为了增加上样DNA溶液的密度，以确保DNA样品沉入点样孔内，溴酚蓝主要是起DNA电泳时的前
沿指示剂的作用。一般溴酚蓝的电泳迁移位置，相当于300～400bp双链线状DNA。因此可以根据溴酚蓝的迁移速率大致估计DNA片段的迁移速率。如果电泳样品有相当于溴酚蓝迁移速率的DNA片段，可以只用50％的蔗糖（或甘油）作上样缓冲液，上样缓冲液是上样体积的1/5。
（五）凝胶中DNA的浓度计算与纯度分析
(1)纯度分析在琼脂糖凝胶电泳中，各DNA、RNA带在电泳胶上相应的位置中分离得清清楚楚（见图10-3）。因此它比分光光度计与溴化乙锭-标准浓度DNA比较法更直接、准确。其中1、3样品纯度好，2、4、5、6有较多RNA与蛋白质。样品在胶中如有RNA、染色体DNA、蛋白质（蛋白质与DNA结合，在点样孔内产生荧光亮点），可想法进一步纯化，如果需要量少可以制备更大容量的琼脂糖凝胶，通过电泳分离，然后从胶中切割下来进行纯化。
图10-3
(2) DNA片段的浓度计算：用λ-Hind Ⅲ酶切DNA作的标准样品，总DNA为48502bp，λDNA用Hind Ⅲ酶切后共有8个片段，依次为：23130bp, 9416bp, 6557bp,4850bp, 2322bp、2027bp, 504bp、125bp, λ-Hind Ⅲ酶切DNA浓度为0.35μg/μL,上样体积为3μL。待测 DNA样品有pBR322 EcoRⅠ酶切片段，上样2μL。见图10-4所示。
图10-4
①从图中pBR322 EcoRⅠ在紫外灯下条带的亮度与Hind Ⅲ的第四个片段大致相同。因此pBR322 EcoRⅠ的浓度通过如下计算：
48502（λDNA总bp数）/1050（λDNA上样浓度3μL×350ng）=4361（pBR322 EcoRⅠ总bp数）/pBR322 EcoRⅠ2μL的浓度
pBR322 EcoR Ⅰ酶切DNA的浓度=47.2ng/μl。
②从图中酶切为两个片段，或三个片段的DNA也可以算样品的相应浓度，估计出DNA的相对含量。
七、思考题
1、DNA的琼脂糖电泳的基本原理是什么？
2、质粒DNA电泳后的图的形态是怎么样的，每个条带代表什么？
3、如果某种质粒中含有两个EcoRⅠ酶切位点，当用EcoRⅠ酶切后的电泳图将会是怎么样的？
八、参考文献
1、彭秀玲、袁汉英、谢毅、王洪海编著，基因工程实验技术（第二版），湖南科学技术出版社，1998，p42-48