感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD590来控制。密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 试剂的质量：所用的等均需是最高纯度的（OR或AR），并用所能获得的最纯净的水配制。
七、思考题
1. 制作感受态菌的过程中，应注意那些关键步骤？ 2. CaCl2溶液的作用是什么？
实验四十 质粒DNA的提取及纯化
一、目的要求
学习小规模制备质粒DNA的技术。 二、实验原理
在载体中，有pUC系列、pBS与pBR322均属拷贝数较高的质粒，只要用小规模制备一次的质粒DNA，就有足够的量用于常规的基因工程操作。小规模制备质粒DNA的特点是可以一次制备多种质粒DNA (12～24个不同的质粒DNA样品），速度快，时间省，步骤简化，DNA纯度好，可以用于酶切，连接，甚至多纯化几次还可做双链DNA序列分析的模板等常规基因工程操作之用。
碱变性法抽提质粒DNA原理是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
用各种不同孔径的凝胶柱层析，进行分离纯化蛋白质、酶、核酸等生物样品的技术。目前也常用DNA的微量过柱以达到纯化DNA的目的。DNA的微量过柱常用Sephadex G50葡聚糖凝胶，做成约300μL凝胶的Eppendorf管小柱，对1～5μg的DNA样品离心过滤20秒钟，就能得到很高的纯化效率。这种过柱的样品可以直接进行DNA测序分析。
三、仪器及器材
超净工作台、隔水式电热恒温培养箱、恒温空气摇床、台式高速离心机、微量移液器
四、试剂
1、大肠杆菌DH5α 2、 LB液体培养基
3、氨苄青霉素(Amp)，临用时用无菌水配制在无菌Eppendorf管中，浓度为100mg/ml，可存于-20℃数周。按1：1000使用。
4、链霉素(Str)，临用时用无菌水配制在无菌Eppendorf管中，浓度为50mg／ml，可存于-20℃数周。按1：1000使用。
5、溶菌溶液：20ml
4mg/ml溶菌酶 50mmo1/L葡萄糖 10mmol/L EDTA
25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 配制方法：临用前吸取母液配制
200mmol/L葡萄糖 5ml 250mmo1/L EDTA 0.8ml 1mmil／L Tris-HCl(pH8.0) 0.5ml 称取溶菌酶 80mg 加ddH2O至20ml 6、碱性SDS溶液80ml
0.2mo1/L NaOH 1% SDS 配制方法：吸取母液
10mo1/L NaOH 1.6ml 20% SDS 4ml 加dd H2O至80ml。 7、3mol/L NaAc（pH4.8)溶液40ml 8、1.5mol/L KAc (pH4.8)溶液50ml
称取乙酸钾7.35g，加30ml重蒸水，加热溶解，再用冰乙酸约5ml调pH至4.8,加重
蒸水定容至50ml。
9、100mmol/L NaAc，5Ommol/L Tris-HCl (pH8.0)溶液30ml 配制方法：吸取母液
3mol/L NaAc 1ml lmol/L Tris-HCl (pH8.0) 1.5ml 加ddH2O至30ml 10、异丙醇、无水乙醇、TE缓冲液 11、氯仿:异戊醇(24:1)溶液
12、 Tris-HCI (pH8.0)溶液饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1）临用时取Tris-HCl饱和酚，加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，即可。
13、 70％乙醇
量取95％乙醇70ml，加重蒸水25ml混匀，置4℃冰箱备用。 14、10mg／ml RNase A溶液 15、5mmol/L NaCl溶液 16、13％PEG溶液
称取6.5g聚乙二醇6000(PEG)，加入40ml，加热充分溶解，加重蒸水定容至50ml 五、操作方法
1.将含有质粒的大肠杆菌DH5α，菌落各挑取一环分别接种在2ml／10ml试管含有抗菌素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，16～18小时（每个菌株各接种3支）。
2.转移以上各株菌液1.5ml于Eppendorf管中，以高速台式离心机在室温下14kr/min离心15秒。
3小心移去上清液，把Eppendorf管倒立在吸水纸上吸干，再把沉淀物在旋涡混合器上摇匀。
4.加入100μL溶菌溶液，把Eppend.rf管子盖紧，倒翻4次，冰水浴放置10分钟。 5.加入200μL碱性SDS溶液，温和地翻转Eppendorf管5次（可观察到溶液逐步由混浊变为透明）冰水浴5分钟。
6.再加入150μL 3mo1/L NaAc (pH4.8)溶液，将Eppendorf 管盖紧后轻轻来回倒翻2～3次，混合均匀后于冰水浴20分钟
7.高速台式离心机，14k r/min，室温离心15分钟。
8将上清液转移到另一个Eppendorf管中（不要把底部混浊物吸进去）。加入1ml冷的无水乙醇（或加满为止），盖紧，并翻倒Eppendorf管3次。
9把Eppendorf管放在-20℃冰箱30分钟～1小时，沉淀DNA或者放置在液氮罐的液氮介面上方5分钟沉淀DNA(千万不能把样品浸在液氮内），也可以放在干冰加酒精中（-70℃）15分钟。
10.取出样品，在高速台式离心机中15kr/min离心10分钟。
11移去上清液（可以倒去），加入室温100mmol/L NaAc, 50mmo1/L Tris(pH8.0)的溶液100μL，让DNA完全溶解（约10分钟）。
12摇匀样品后再加入200μL冷的无水乙醇，放置在-70℃冰箱10分钟。 13. 在高速台式离心机中15kr/min离心10分钟，收集沉淀物。
14.用100μL 100mmol/L NaAc，50mmo1/L Tris-HCI (pH8.0)，溶解DNA。并加入4μL核糖核酸酶（lmg/ml的RNase A，临用前将l0mg/ml的RNase A稀释10倍) 37℃保温15分钟。
15.加入200μL预冷无水乙醇，放置在-70℃，5分钟沉淀DNA。 16在高速台式离心机中15kr/min离心10分钟，收集沉淀物。
17. 加500μL 70％乙醇于Eppendorf管中，2分钟后倒去，弃去70％的乙醇，然后将Eppendorf管倒吸在卫生纸上，尽量吸干乙醇，用parafilm包口，打洞，在真空中抽干。
18每管沉淀物加40μL无菌重蒸水，用手轻弹数下溶解质粒DNA,或旋涡振荡器振荡，离心2秒钟，集中DNA (几管合并于一管，仅加20μL ddH2O)。
19.取样5μL，在0.8％的琼脂糖凝胶（加EB)中电泳，小电泳槽电压为40～100V, 30分钟到1小时。
20观察DNA区带，鉴定分离的DNA。
如果分离不纯可用下列步骤再度纯化，尤其是进行酶切之前，更为必要。 ①加200μL TE,再加入等体积的酚、氯仿和异戊醇（体积之比为25:24:1)，混合后，以8kr/min离心5分钟，吸取上清液至另一个Eppendorf管中。
②把留在原Eppendorf管中的有机溶剂相，再加入等体积的TE缓冲液，以8kr/min离心5分钟，取出上清液合并到上一个Eppendorf管中的上清液里（小心操作，不要把中间层的蛋白质污染进来）。
③重复抽提一次：加入等体积（相当于①步的二倍体积）的氯仿和异戊醇（24:1），混匀后以8kr/min离心5分钟，取上清液于另一个Eppendorf管中。
④加入5mol/L NaCl至最终浓度为20mmol/L，然后加入2倍体积的无水乙醇，置-70℃冰箱10分钟或液氮罐表面5分钟沉淀DNA。
⑤以15kr/min离心15分钟，弃去上清液，再加70%乙醇500μL洗涤沉淀物，弃去乙醇，再放真空箱抽干。
⑥加入20μL TE缓冲液，用手反复弹几次，或旋涡振荡器振荡溶解，离心2秒钟以集中DNA，存于-20℃备用。
六、注意事项
1.实验安排：三个实验方法一天内就可制备36个以上DNA样品，只需要在实验的前一天下午接好菌，培养过夜。并作些器皿与试剂的准备工作，而溶菌溶液，碱性SDS溶液中各成分要在实验临用前将母液配制在一起。三个方法的菌液离心可一次进行，然后再分别按三个方法的步骤进行。为了避免搞错，在编号上要做好记号，在写号码时，最好养成一个习惯，如顺着Eppendorf柄的方向写，这样可以免去把9与6, 12与21等顺序搞错，特别是每次用酚、氯仿、乙醇等有机溶剂时，要注意盖紧，不要把写的号码搞乱了，做的样品多了，尤为要注意。
2.方法的改进：该法是快速制备少量的质粒DNA,它可供限制性内切酶酶切，疑胶电泳。Southern blot与DNA序列分析等使用，当实验一提取pBR322质粒DNA在数量上要求不多时，也可以采用该法提取。在我们教材中，多处介绍提取质粒DNA的各种方法。便于大家因地制宜的采用。而本实验中的提取方法，在许多实验室都经常地采用它，因而积累了许多不同的经验，目前国内外一些实验室，又将碱变性SDS法的实验进行简化，并用异丙醇代替乙醇，大大缩短了实验的时间，现将方法介绍如下：
单细胞菌落接种到2ml LB培养液（相应抗菌素） 振荡培养3～4小时或过夜 将培养液装满在Eppendorf管中
离心后弃上清液，加入100mmo1/L Tris-HC1 (pH7.5)、5mmo1/L EDTA 缓冲液100μL
充分悬浮
加入200μL的0.2mol/L NaOH、1％SDS溶液，冰浴10分钟
加入150μL的3mol/L KAc (pH4.8)溶液，冰浴10分钟
15kr/min离心10分钟，吸出上清液，加入1ml异丙醇，于室温（～18℃）15～30