化，使酶的活性降低，称这些物质为酶的抑制剂。如Cl是唾液淀粉酶的激活剂，而Cu2+则是它的抑制剂。
酶的激活剂种类很多，其中主要是一些简单的无机离子，如Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、
－－－－－
等阳离子和Cl、Br、I、PO43、NO3等阴离子；其次一些中等大小的有机分子，如抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱苷肽等是某些含巯基的酶的激活剂；能除去抑制剂的物质也称为激活剂，如EDTA能除去重金属，因而能解除重金属对酶的抑制作用。
＋＋＋
酶的抑制剂有许多种，如重金属离子(Ag、Hg2+、Pb2、Cu2等)、砷化物、氟化物、生物碱、有机磷农药等都是抑制剂。
激活剂和抑制剂影响酶活性常具有特异性，如Mg2+对脱羧酶、烯醇化酶等有提高活力的作用，而对肌球蛋白ATP酶则有降低活力的作用。激活剂和抑制剂影响酶活性的剂量是
－
很少的，并且同一种酶可因激活剂的浓度不同而作用不同，如CI在低浓度时为唾液淀粉酶的激活剂，而在高浓度时（达到1／3饱和度）就可抑制唾液淀粉酶的活性。
在本实验中，以稀释的唾液作为淀粉酶液。唾液内的淀粉酶可将淀粉逐步水解为不同阶段的产物，它们遇碘呈不同的颜色，以此来定性研究激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的作用。直链淀粉(即可溶性淀粉)不同水解阶段的产物与碘反应的颜色如下：
不同水解的产物：淀粉→ 紫色糊精→ 红色糊精→ 麦芽糖及少量葡萄糖 与碘的颜色： 呈蓝色→呈紫色→ 呈红色→ 不显色
－
三、实验材料与器材
1．实验材料
新鲜唾液，淀粉。 2．实验器材
普通试管：20mL×4；移液管：lmL×4，2mL×1，5mL×l；100mL容量瓶，150mL三角瓶；恒温水浴箱；试管架；漏斗。
四、实验试剂
1．0.1%淀粉溶液 2．l%NaCI溶液 3．1%CuSO4溶液 4．1%Na2SO4溶液
5．KI-I2溶液：称取碘化钾3g及碘1g溶于100mL蒸馏水中。 6．0.2mol/L pH6.6的磷酸缓冲液
五、操作步骤
1．唾液淀粉酶液的制备：取唾液lmL放人100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至100mL，用脱脂棉花过滤至150mL三角瓶，备用。唾液稀释倍数因人而异，可稀释50～400倍，甚至更高。
2．激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响
取试管4支，按下表操作。
表28 激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响
操作
试管号
1
pH6.6缓冲液(mL) 0.1%淀粉溶液(mL) 1%CuSO4溶液(mL) 1%NaCl溶液(mL) 1%Na2SO4溶液(mL)
蒸馏水(mL)
唾液淀粉酶(mL) KI-I2溶液(滴) 记录颜色变化
3 1 1 1
2
各2mL 3 1 1 1
3 3 1 1 1
4 3 1 1 1
混匀，置37℃恒温水浴保温10min
六、实验结果与分析 七、注意事项
1．如1，2，3，4管呈色反应无明显差别，可能是唾液淀粉酶活力太高或太低，若酶活力太高可将酶稀释后重做；若酶活力太低，可延长保温时间或增加酶的浓度。
八、思考题
1．酶促反应的抑制作用有哪几种类型? 2．本实验中，为什么要设计第4管?
实验五 血糖含量的测定
一、目的要求
1．掌握Folin——吴氏法测定血糖的原理和方法 2．了解血糖测定的临床意义
二、实验原理
血液中的葡萄糖含量是人体非常重要的生理指标，一般血糖正常值为80～120mg%。当血糖超过120mg%时，称高血糖症；若血糖低于70mg%称为低糖症。血糖增高多见于糖尿病，甲亢，脑垂体前叶机能亢进，肾上腺皮质和髓质机能亢进等．而血糖过低，多见于胰岛素分泌过多，肾上腺皮质机能减退，脑垂体前叶机能减退，甲状腺机能减退等。
全血经除蛋白后，滤液中的葡萄糖在碱性条件下，与硫酸铜共热，其兰色的二价铜离子（Cu2+）被还原成砖红色的氧化亚铜（Cu+）沉淀，后者可使磷钼酸还原成钼兰，形成蓝色溶液。如与同样处理的标准葡萄糖在620nm处比色，即可求出血中葡萄糖的含量。
反应式： Na2CO3+H2O NaOH+NaHCO3 2 NaOH+CuSO4 Cu(OH)2+Na2SO4
加热 CuO 2 Cu(OH)2+C6H12O6 + C6H12O5COOH+2 H2O 2
3Cu2O+3H3PO4?3MoO3?12 H2O 3H3PO4?3MoO2?12 H2O+6CuO
三、仪器及器材
.分光光度计，电炉，恒温水浴锅，烧杯，试管
四、试剂
1．碱性铜试剂：称取无水碳酸钠40g,溶于100mL蒸馏水中溶后加酒石酸7.5克若不溶解可稍加热，冷却后移入1000mL容量瓶中。另取纯结晶硫酸铜4.5g,，溶于200mL蒸馏水中，溶后将此液倒入装上液的容量瓶中，加蒸馏水至1000mL刻度，摇匀，备用。
2．磷钼酸试剂：取纯钼酸70克，溶于10%NaOH 400毫升中，再加Na2WO4 10g，加蒸馏水至总体积为800mL，加热煮沸30-40分钟（以除去钼酸中可能存在的氨）冷却后加85%磷酸250mL，加蒸馏水至1000mL刻度，摇匀，贮棕色瓶中。 3．标准葡萄糖液
贮存液（1.0mL=10mL葡萄糖）：准确称取葡萄糖1.0g,用0.25%苯甲酸液溶解，倾入100mL容量瓶，最后加0.25%苯甲酸液至刻度，摇匀，放置冰箱中保存。
应用液 （1.0=0.025mg葡萄糖）：准确取上述贮存液0.5ml，移入200mL容量瓶中，加0.25%苯甲酸液至刻度。
4．0.25%苯甲酸液：称取苯甲酸2.5g，加入煮沸的蒸馏水1000mL中，使成饱和溶液，冷却后，取上清液备用。 5．10%Na2WO4。 6．2/3N H2SO4
五、操作方法
1．除蛋白血滤液的制备： 取试管1支，准备加入蒸馏水3.5mL，血液0.1mL，2/3N H2SO4 0.2mL，10%Na2WO40.2mL，混匀.待有澄清出现后，过滤，收集滤液备用。 2．取试管3支，编号，按下表操作。
表5 血糖含量的测定
编号 标准葡萄糖液 除蛋白血滤液 蒸馏水 碱性铜试剂 磷钼酸试剂 蒸馏水
标准管 2.0 2.0 2.0
混匀，放置3分钟 3.0
3.0
3.0
将各管混匀后，以空白管调零点，在620nm处比色。
测定管 2.0 2.0 2.0
空白管 2.0 2.0 2.0
充分混匀，置沸水中准确煮沸8分钟，取出切勿摇动，置冷水中冷却
六、数据处理及分析：
血糖（mg%）= 测定管光密度（Du）/ 标准管光密度（Ds）× 0.05× 4/2× 100/0.1 =测定管光密度/标准管光密度×100
七、注意事项
1．本法所测得的血糖值，并非是真正的葡萄糖，滤液中还有其他还原物质的干扰（约10%），故结果偏高。
2．血糖测定应在取血后2小时内完成，放置过久，糖易分解，致使结果减低。 3．磷钼酸试剂宜贮于棕色瓶中，如出现兰色，表明试剂本身已被还原，不能再用。 4．碱性铜试剂中如出现氧化亚铜沉淀也不可用。
八、思考题
1．为什么在测血糖时需先将蛋白除去？
九、参考文献
1．南京大学生物系编.生物化学实验（第1版），人民教育出版社，1979，p4-7
实验三十七 SOD活性的测定
一、实验目的：
1．了解SOD活性的测定方法。
2．掌握在酶的提取及纯化过程中计算酶的比活力、活力回收率、纯化倍数的方法及意义。
二、实验原理：
SOD活力的测定方法有很多种，其中以化学法应用最为普遍。化学测定法包括两个方面：一是产生超氧自由基，如黄瞟吟氧化酶起作用时会产生氧自由基，肾上腺素自氧化、邻苯三酚和连苯三酚在碱性条件下自氧化都能产生氧自由基；二是对氧自由基的检测，多数是利用反应液中能与氧自由基起作用，并易于被检测的指示物质的浓度变化来测定SOD活性。常用的测定方法有：黄瞟吟-黄瞟吟氧化酶-细胞色素C法；氮蓝四唑-核黄素法和邻苯三酚法、连苯三酚法。本实验采用氮蓝四唑-核黄素法。
本实验利用氮蓝四唑-核黄素法方法测定SOD的活性。核黄素在光照下会产生超氧阴离子自由基，产生的超氧阴离子自由基会使硝基四唑蓝还原，产生蓝色甲簪（在560nm有吸收峰），而SOD可以清除超氧阴离子自由基，抑制反应的发生。一个酶的活力单位定义为将硝基四唑蓝的还原抑制到对照一半（50%）时所需的酶量。根据测定的SOD的活力，来计算酶纯化过程中不同处理步骤获得的酶的比活力、活力回收率和纯化倍数，考核各步处理的综合效果。酶的比活力是指每毫克酶蛋白所含有的酶活力单位数，它是酶制剂纯度的一个指
标。酶的回收率是指纯化过程中酶活力的收率，它是提纯后与提纯前酶的总活力的比值。纯化倍数是提纯后与提纯前酶比活力的比值。
三、实验器材
723型分光光度计；移液管；吸耳球；试管
四、实验试剂
1．标准蛋白质溶液：可用牛血清清蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成lmg／mL的溶液。
2．蛋白试剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%（W／v）磷酸，将溶液用水稀释到1000mL。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%（W／V）乙醇，和8.5%（w／V）磷酸。 3．50mmol/LpH7.8磷酸盐缓冲液
4．反应介质：用50mmol/LpH7.8磷酸盐缓冲液配制（内含77.６μmol/L硝基四唑蓝，0.３μmol/LEDTA，13.45mmol/L蛋氨酸）
5．核黄素：用50mmol/LpH7.8磷酸盐缓冲液平配制(内含20μmol/L核黄素)
五、实验步骤
1．超氧化物歧化酶活力的测定
（1）酶液：来自实验31－35保存的样液，用50mmol/LpH7.8磷酸盐缓冲液进行适当（如下要求）的稀释。
（2）SOD活性测定：取7支试管，按下表加入试剂，将对照管用黑纸包裹，然后一起放到
光照下，光强3000 lx，照光时间15min，反应后以黑纸包裹的管为对照，测定各管在560nm的吸光度。
表37-1 SOD活性测定
管号
反应介质（mL） 酶提取液（mL） 核黄素（mL） 50mmol/LpH7.8 PBS 光吸收值（A560）
对照 （黑纸包裹）
对照 (A0)
样1
样2
样3
样4
样5
２.9 0.３ 0.１ ２.9 0.３ 0.１ ２.9 0.１ 0.３ ２.9 0.１ 0.３ ２.9 0.１ 0.３ ２.9 0.１ 0.３ ２.9 0.１ 0.３
各样品中酶液用量以抑制反应在30%－70%为宜。 2．蛋白质含量的测定
（1）蛋白质标准曲线的制作：按下列表配制溶液，配制好的各溶液，充分振荡混合，3分钟后以0号管为对照，在595nm处测定吸光度。
表37-2 蛋白质溶液标准曲线的测定
管号
100μg/mL标准蛋白质溶液（mL）
蒸馏水（mL）
0 0 1.0
1 0.2 0.8
2 0.4 0.6
3 0.6 0.4
4 0.8 0.2
5 1.0 0