分别从每管2mL的收集液中取0.4mL于对应的后两排试管中，一支管中加2滴BaCl2，根据白色沉淀多少，判断SO42-在各管中的浓度。另一支管加lmL考马斯亮蓝G—250试剂，根据蓝色情况，判断蛋白质在各管中的浓度。
如果鉴定的第7号管中，仍有样品(蛋白质或SO42-)，表明洗脱和收集未完，需增加试管继续洗脱与收集，同上法鉴定其蛋白质和盐浓度情况。 8．凝胶再生
鉴定完毕，打开出水口，继续用2—3倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口。以备下次使用。
长时间不同或者用的次数过多，凝胶床体积变小，流速降低，凝胶污染杂质过多，甚至变色，则需要对凝胶进行再生处理，即把凝胶倒出，用6mol／L脲浸泡凝胶0.5h，抽滤，再用水漂洗数次，加入几滴氯仿，摇匀存放在冰箱的冷藏室内保存。
六、结果处理
1．绘制洗脱曲线
根据实验结果，在同一坐标系中，以收集的管号为横坐标，颜色深浅程度为纵坐标，绘制样品洗脱曲线。
2．根据洗脱曲线分析分离效果。
七、思考题
1．利用凝胶层析分离混合物时，应该怎样选择凝胶的类型？ 2．凝胶层析分离混合物时，怎样才能得到较好的分离效果?
八、参考文献
1.邱广亮,李咏兰,石晶瑜,栗淑媛.绿豆胚超氧化物歧化酶的纯化及性质研究.精细化工,2000,17:57-59
2.张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验技术方法和技术（第2版），高等教育出版社，1997，p217-222
实验十六 考马斯亮兰法测定蛋白质的含量（Bradford法）
一、目的要求
掌握考马斯亮兰法测定蛋白质的原理和方法。
二、实验原理
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1?g。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 ?—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
三、实验器材
可见光分光光度计、旋涡混合器、试管10支
四、试剂
1．标准蛋白质溶液：可用牛血清清蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成lmg
2．蛋白试剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%（W／v）磷酸，将溶液用水稀释到1000mL。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%（W／V）乙醇，和8.5%（w／V）磷酸。
五、操作方法
1．标准曲线和样品的测定：取9支试管，1支作空白，3支留作未知样品，按下表分别加入样品、水和试剂，最后各试管中分别加入4.0mL考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。
2．比色：加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管。
表16 蛋白质标准曲线和蛋白质含量的测定
管号
100μg/mL标准蛋白质溶液（mL） 蒸馏水（mL） 样液（mL）
蛋白质含量（μg）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 0.2 1.0 0.8 0 20
0.4 0.6 0.8 1.0 0.6 0.4 0.2 0 1.0 1.0 1.0 40 60 80 100
加入蛋白试剂（mL） 光吸收值（A595）
4 4 4 4 4 4
六、数据处理和分析
1．标准曲线的制作
用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线，以蛋白浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量的依据。 2．蛋白质含量的确定
记录各样品的光吸收值，在标准曲线上查得对应的蛋白质的含量，计算出各提取阶段所得液体中蛋白质的总含量。
七、注意事项
不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。
八、参考文献
1．Boyer, Rodney F. Modern experimental biochemistry 1986, p55-59 2．蔡武成、袁厚积主编：生物物质常用化学分析法，1982，p93~99 3．张龙翔、张庭芳、李令媛等编著，生化实验方法和技术，高等教育出版社，1981，p164~169
实验六 用阳离子交换树脂摄取氯化钠
一、目的要求
通过用阳离子交换树脂摄取氯化钠的实验，学习离子交换层析法的原理和基本操作技术。
二、实验原理
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换树脂是一种带有离子的不溶于水的分子聚合物。离子基团又称活性基团，因它与母体的亲合程度不同，故能与溶液中的离子进行交换，而树脂本身的物理性能不变。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂 。
离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。
由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
本实验所用强酸型阳离子交换树脂，可根据生成盐酸的量来检验交换程度，盐酸生成量可用中和滴定法分析，酚酞变浅红色，半分钟不退为终点。
基质——SO3H 为H型
＋
基质——SO3Na为Na型
它们在NaOH或HCl溶液中可以进行离子交换
R-SO3H + NaCl RSO3Na + HCl
滴定 HCl + NaOH NaCl + H2O
三、仪器及器材
碱滴定管，层析管，恒压洗脱瓶（可用分液漏斗或下口瓶代用。），锥形瓶，烧杯，玻璃棒，吸管。
四、试剂
1．强酸型阳离子交换树脂（磺酸型）和弱酸型阳离子交换树脂（酚醛型） 2．10 mg／mL氯化钠溶液
3．标准氢氧化钠溶液（浓度为0.1mol／L）
4．酚酞指示剂 5．2 mol／L盐酸溶液 6．2 mol／L氢氧化钠溶液
五、操作方法
1．树脂的处理：
商品树脂732
H2O漂洗去除悬浮固体物，至洗样液澄清 干净732树脂
2NNaOH浸洗2h去除NaOH，用水洗至中性 732型树脂
2NHCA浸泡2h去除HCl，用水洗至中性 732型树脂
2NNaOH浸洗2h去除NaOH，用水洗至中性 732型树脂
2NHCA浸泡2h去除HCl，用水洗至中性 732型树脂(H型)
浸泡时可加电动搅拌装置，使效果好
2．装柱：先在空柱中装入少量H20开启螺旋夹，赶走气泡，使水缓缓下滴。将带水的树脂通过漏斗连续装入层析柱，装至3／4～2／3柱高，防止断层和气泡，树脂床顶层平面状态，并低于水平面。
3．加样：将层析柱底部螺旋打开，树脂床上层H20缓缓滴下，待水弯月面接近树脂床平面时，用滴管一滴滴慢慢加入NaCl溶液共6ml，做到不冲床
4．洗脱与收集
打开层析柱底部螺旋夹，使所加NaCl液缓缓下降，进入树脂床。待NaCl液弯月面正处在树脂床平面顶端时，先用滴管一滴滴将H20加到层析柱内，避免水滴冲床，待H20加至一定高度，再盖上洗脱瓶，将H20注满洗脱瓶．与此同时用50mL量筒在层析柱下部收集滴出液共40ml，注意控制水滴速度，一般1滴／5秒。 5．测定
将40mL收集液转移入100mL三角瓶，加酚酞2滴，用标准NaOH液进行酸碱中和滴定，记录所用NaOH毫升数VNaOH。
六、数据处理及分析
计算钠离子的交换率，并讨论实验结果。
Na+交换率=0.1?VNaOH?58.5?100％
6?10VNaOH：滴定时所消耗标准NaOH毫升数。
七、注意事项
1．树脂在使用一段时间后，要进行再生处理。 2．装柱时不能出现断层和气泡。
八、思考题
1． 收集滴出液时，为何流速不能太快？
2．在使用离子交换层析法分离蛋白质时需考虑哪些问题？
九、参考文献
1．北京师范大学生物系生物化学教研室编.基础生物化学实验（第1版），高等教育出版社出版社，1982，p186-187
2．陈毓茎 主编.生物化学实验方法和技术（第1版），科学出版社，2002，p13
实验二十八 激活剂和抑制剂对酶活性的影响
一、目的和要求
1．了解激活剂和抑制剂对酶活性的影响。
2．学习鉴定激活剂和抑制剂影响酶活性的原理和方法。
二、实验原理
在酶促反应过程中，酶的活性常常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活力增加，称为酶的激活剂；有些物质它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上的某些必需基团发生变