在仪器确定的情况下，着重考察溶液浓度变化对吸光度线性的影响。
三、仪器及器材
紫外—可见分光光度计，试管，试管架，容量瓶， 烧杯，吸管，玻璃棒1根
四、试剂
牛血清白蛋白溶液(1mg/mL)：称取牛血清白蛋白(BSA)500mg，用少量水溶解后定容至500 mL。
五、操作方法
1．含量为100～500μg/mL牛血清白蛋白的光吸收情况
取6支试管，按表2-1操作，以第1管为空白对照，测定各管的吸光度。
表2-1 100～500μg/mL牛血清白蛋白的光吸收的测定
试管号
1mg/mL的牛血清白蛋白（mL）
蒸馏水（mL）
牛血清白蛋白的含量（μg/mL）
A280
1 0 5 0
2 0.5 4.5 100
3 1.0 4 200
4 1.5 3.5 300
5 2.0 3 400
6 2.5 2.5 500
2．含量为0.1～0.5μg/mL牛血清白蛋白的光吸收情况 （1）样品稀释
取l00mL容量瓶1只，准确加入0.1mL浓度为lmg/mL的牛血清白蛋白溶液，加水稀释至刻度，为1μg/mL牛血清白蛋白稀释液。
（2）按下表操作，以第1管为空白对照，测定各管的吸光度。
表2-2 0.1～0.5μg/mL牛血清白蛋白的光吸收的测定
试管号
1μg/mL的牛血清白蛋白（mL）
蒸馏水（mL） 牛血清白蛋白的含量（μg/mL）
A280
1 0 5 0
2 0.5 4.5 0.1
3 1.0 4 0.2
4 1.5 3.5 0.3
5 2.0 3 0.4
6 2.5 2.5 0.5
六、数据处理及分析
在坐标纸上以牛血清白蛋白含量(μg/mL)为横座标，以相应各管吸光度为纵座标，分别绘制分光光度计线性分辨范围曲线，并对结果进行分析，找出牛血清白蛋白含量的线性范围。
七、注意事项
1．溶解牛血清白蛋白时不可剧烈搅拌，避免产生泡沫。 2．分光光度计用氘灯，比色时用石英杯。
八、思考题
1．适于光谱分析的溶剂应具备哪些性质?
2．在用分光光度计做比色测定时，如何选择波长和狭缝? 3．为减少比色的相对误差，吸光度应控制在什么范围?
九、参考文献
1．陈雅蕙 等编.生物化学实验原理和方法（第2版），北京大学出版社，2005，p178-188 2．陈毓茎 主编.生物化学实验方法和技术（第1版），科学出版社，2002，p73-76
实验十 酵母RNA的分离及组分鉴定
一、目的
学习核酸的制备方法，了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。
二、原理
酵母中富含核酸，主要是RNA(约占干重3-10%)，DNA则很少，酵母RNA提取过程是先使RNA从酵母细胞中释放出来，并把它和蛋白质分离。RNA与蛋白质的分离是采用稀碱溶液溶解法，再离心使之与菌体蛋白分离。由于DNA在稀碱溶液中较稳定，因而DNA随菌体蛋白一起弃去，使得DNA和RNA分离。然后利用核酸在酸性乙醇中不溶解的性质，使RNA沉淀下来。
RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
三、器材
量筒(100mL)、烧杯(100mL)、锥形瓶(100mL)、抽滤瓶、布氏漏斗、移液管(1mL、2mL)、滴管、玻璃、离心机、离心管(80mL)、试管及试管夹、水浴锅、台秤、天平、石蕊试纸等。
四、试剂
1．干酵母粉或新鲜酵母(市售)
2．0.2%氢氧化钠溶液：2g NaOH溶于蒸馏水并稀释至1000mL
3．10%硫酸：量取10mL浓硫酸(比重1.84)缓缓倒人86mL蒸馏水中 4．95%乙醇 5．无水乙醚 6．氨水 7．乙酸
8．5%硝酸银溶液：5g AgNO3溶于蒸馏水并稀释至100mL，贮于棕色瓶 9．钼酸铵试剂：29.0g钼酸铵溶于3N 400mL的硝酸溶液中
10．苔黑酚一三氯化铁试剂：将100mL浓盐酸中，再加入100mgFCl3.6H2O(临用时配制)。
五、操作方法
（一）RNA的提取：取5g干酵母粉（或25g新鲜酵母）于250mL烧杯中，加入0.2%NaOH
溶液40mL，沸水浴30min并经常搅拌，冷却后转移到离心管中，以4000 r／min离心15min，将上清液倾人100mL烧杯中，加入醋酸数滴，使提取液pH为2.5，边搅拌边加入95%乙醇30mL，加毕静置10min使沉淀完全，然后转移至离心管中以4000r／min离心10min。弃去上清液，将离心管底部的沉淀用95%乙醇约20mL充分搅拌洗涤，并转移至布氏漏斗中抽滤，再用95%乙醇和乙醚(各约20mL)分别淋洗，所得的滤渣即为粗RNA制品。将制得的RNA制品在滤纸上风干，称重。
（二）RNA的鉴定：取约0.2g RNA制品放人试管中，加入10%硫酸5mL，在沸水浴中加热10-20min，边加热边摇动，得RNA水解液，然后取3支试管按下述方法进行组分的鉴定：
1. 嘌呤碱：取水解液2mL，加入浓氨水2mL，再加入5%AgN03溶液1mL，观察有无白色絮状嘌呤银化物出现。
2. 核糖：取水解液0.5mL，加入苔黑酚一三氯化铁试剂1mL，置沸水浴中加热片刻，注意观察溶液是否变成鲜绿色。
3. 磷酸：取水解液2 mL，加入钼酸铵试剂2mL，观察是否有黄色磷钼酸铵沉淀出现。
六、实验结果及分析 七、注意事项
RNA提取的关键操作是用乙醇洗涤离心管中的沉淀时，搅拌要充分。
RNA进行酸水解时，最后得到的水解液要澄清，如有沉渣，最好进行过滤。
八、思考题
1．工业上制备RNA有几种方法，制备的原理是什么？ 2．本实验中为什么加入乙醇，作用如何？
实验十二 紫外吸收法测定核酸的含量
一、目的要求
1. 通过实验，了解紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。 2. 进一步熟悉紫外分光光度计的使用方法。
二、实验原理
核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C一），能够强烈吸收250-280nm波长的紫外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。
在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核
酸磷的溶液在260nm波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。在pH=7.0时两种核酸的消光系数及相关数值如表。
表12 核酸摩尔消光系数及相关数值
RNA DNA-Na盐 （小牛胸腺）
ε(P) pH7，260nm 7700-7800 6600
含磷量/(%)
9.5 9.2
A260nm 1μg/ml 0.024 0.020
采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm波长下，浓度为1μg/mL的DNA溶液其光密度为0.020，而浓度为1μg/mL的RNA溶液其光密度为0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度A260nm，即可计算测出其中核酸的含量。
蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nmx吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法先除去。
该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg／mL的含量即可测出。
三、实验材料和器材
1．测试材料
样品RNA或DNA干粉。 2．器材
电子分析天平，离心机，离心管，紫外分光光度计，烧杯，冰浴，容量瓶（50ml），移液管，试管及试管架。
四、实验试剂
1．钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4ml蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵－2.5%过氯酸溶液。
2．5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。
五、操作步骤
1．准确称取待测的核酸样品0.5g，加少量蒸馏水（或无离子水）调成糊状，再加适量的水，用5%~6%氨水调至pH7，定容到50mL。
2．取两支离心管，甲管内加入2mL 样品溶液和2mL 蒸馏水；乙管内加入2mL 样品溶液和2mL 沉淀剂（沉淀除去大分子核酸，作为对照）。混匀，在冰浴（或冰箱）中放置30min，3 000r/min 离心10min。从甲、乙两管中分别取0.5mL 上清液，用蒸馏水定容至50mL。选用光程为1cm 的石英比色杯，在260nm 、280nm波长下测其光密度。
如果待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则可将样品配制成一定浓度的溶液（20~50μg/mL）在紫外分光光度计上直接测定。
六、数据处理
1．计算核酸的浓度（μg/mL）
RNA或DNA浓度＝?A260?N0.024(或0.020)?L
?A260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值。式中，
N为稀释倍数，L为比色皿的光径。
在计算纯净的样品时，ΔA260直接换成纯样品的A260即可。
2．计算A260和A280的吸收比值
七、分析讨论 八、思考题：
1．干扰本实验的物质有哪些？
2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？
实验三十二 绿豆超氧物歧化酶的提取
一、目的：
本实验通过对绿豆中SOD的分离，掌握从细胞中抽提酶的原理和方法。
二、原理
超氧化物歧化酶(superoxidc dismutase，简称SOD，EC 1.15.1.1)是广泛存在于动物、植物和微生物中的金属酶，它的功能是催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢和氧：
SOD作为一种重要的抗氧化剂，它对于维持生物体内自由基的产生和清除之间的平衡起着重要的作用。在某些病理情况下，自由基产生和清除功能失去了平衡，不论其原因是自由基产生过量，还是不足，或者是机体清除自由基的能力减弱，都会导致疾病的发生或衰老。目前人们已开始研究它在治疗放射病以及抗炎症和抗衰老等方面的临床应用。
SOD在生物体内是一组同工酶，按照SOD活性中心所含的金属离子不同，SOD可分为Cu·Zn-SOD，Mn-SOD和Fe-SOD三种。这三种酶活性部位的金属离子与酶蛋白都在催化反应中起到关键作用，但它们的性质与分子结构有所不同。Fe—SOD和Mn—SOD的一级结构和空间结构很相似，但均不同于Cu·Zn—SOD的结构。Cu·Zn—SOD一般是由两个相同的亚基组成二聚体，每个亚基的相对分子质量约为16000，含一个铜原子及一个锌原子。不同来源的Cu·Zn—SOD的氨基酸序列，无论是来自细菌、真菌、高等植物细胞浆或叶绿体，还是来自高等动物和人的细胞浆，它们的同源性都很高。Mn—SOD在真核生物中多为四聚体，在原核生物中为二聚体，大多数Fe—SOD为二聚体。这两种SOD的许多性质都很相似，每个亚基的相对分子质量一般为23000，每个亚基含有0.5～1.0个Mn或Fe原子。任何生物来源的Fe—SOD和Mn—SOD的一级结构的同源性都很高。