6、如手淫取精有困难，可用特制的避孕套进行精液采集，而不能用日常用的乳胶避孕套及性交中断法取精，当手淫法取精不出时，请及时与男性科医生联系。
7、向患者强调精液标本必须采集完整，不完整的精液不宜进行分析。
8、标本运送到实验室过程中，温度应保持在20℃以上，但不能超过40℃。冬天标本采集后，采精杯要贴身转运。
二、逆向射精病人精子的收集
逆向射精通常将精液射向膀胱中，为了在膀胱中收集活精子，必须保持膀胱的良好环境。已经诊断为逆向射精或怀疑逆向射精患者，射精后马上收集尿液处理，如同时有一些精液射出，应单独处理。
程序：
1、患者在取精24小时之前服用小苏打片4g Tid 。
2、取精在早晨进行。早晨起床排尿后，喝500~1000ml的水或茶，禁喝咖啡、果汁和苏打水。
3、患者到达实验室后，取尿样检查pH值和渗透压。理想的pH范围是6.5~8.5，渗透压范围是280~2900sm。如果渗透压大于3000sm，再喝500ml水，15分钟以后，重新检查尿液的pH值和渗透压，直至达到要求，让患者取精后马上排尿，收集尿液。
4、 将尿液收集到离心管中，500g离心20分钟。
5、去上清，收集精子沉淀，在试管中加入IVF-20 2ml 500g离心10 分钟。 6、去上清，留底层液约1.0ml，行精液分析或按精液洗涤程序处理精液。
三、精液常规分析
1、精液的液化：取精后20分钟、30分钟、60分钟观察并记录是否完全液化及液化时间。正常精液标本在室温下60分钟内完全液化。有时精液标本不液化，可用机械混匀或加入等量的培养液并反复吹打，促进液化。这些操作可能影响精浆的生化、精子活力和精子形态学测定，故应记录这些操作。
- 31 -
2、精液的外观：精液标本应在室温下行肉眼观察。正常精液质地均匀，呈灰白色。禁欲时间过长可略带黄色。精子密度非常低或无精子，精液显得透明。如有红细胞，精液可呈红褐色。如有黄疸或服用某些维生素，精液可呈黄色。
3、精液量：用锥形底量筒测定，正常男子精液量≥2ml。
4、精液粘稠度： 将玻璃棒插入精液标本中，提起玻璃棒观察拉丝长度，拉丝长度超过2cm为异常。
5、pH值：在射精后l小时内同一时间测定，将一滴精液均匀涂在pH试纸条上，30秒后，浸润区的颜色应均匀一致，将其与标准带比较，读出pH值。
6、精液的显微镜检查：包括精子密度、活力、存活率、凝集、非精子细胞成分的测定和精子的形态学分析。使用相差显微镜。
①、精子密度初检：如果每个视野的精子数目差异较大，提示标本不均匀。此时应再次吹打混匀标本，再次取样、检测。如果每视野精子少于1～2个，报告精子密度为<2×106／ml，同时注明能否看到活动精子即可。如果显微镜检未见精子，应离心确定沉渣中有无精子。将精液全部吸入离心管在3000g离心15分钟。在显微镜检查沉渣仍无精子，方可作出无精子症的判断。
②、精子活力的评估：观察至少5个视野，计数200个精子进行分级。根据以下标准把精子活力分为a、b、c、d四级：“a”级：快速前向运动 ( 即37℃ 时速度≥25μm/s，或20 ℃速度≥ 20μm/s)。“b” 级：慢速或呆滞的前向运动（5-25μm/s）。“c”级：非前向运动(<5μm/s)。“d”级：不动。首先计数a级、b级精子，随后在同一视野计数c级d级精子。计算各级精子占所有计数精子的百分比。
③、精子凝集：是指活动精子以不同方式，头对头、尾对尾或混合型彼此粘在一起。不活动精子之间，活动精子与粘液丝之间，活动精子与非精子细胞成分、细胞碎片等粘在一起，不能视为凝集，但应照常记录。凝集的记录采用半定量的分级方法：没有凝集(—)，有凝集可根据其程度用(+)、(++)、(+++)表示，所有活动的精子都凝集在一起为(+++)。出现凝集，提示存在不育的免疫原因，但不能充分证明这点。随机选择10个视野检测凝集。精子成簇一起的平均百分率被定为5％左右。凝集的程度可能很重要，即使只有几个精子凝集成为数目很少的团块也应记录。要记录凝集的类型，如头对头、中段对中段、尾对尾或几种类型同时出现的混合型。
④、精子存活率：采用0.5％伊红Y溶液染色。将一滴新鲜精液与一滴伊红溶液在
- 32 -
载玻片上混匀，覆盖玻片，30秒后在400倍显微镜下至少计数200个精子，记数活精子(未染色)占所有精子的百分比。(死精子染为红色)。也可采用低渗肿胀实验，即将一滴蒸馏水滴加到精子涂片上，观察精子尾巴卷曲肿胀的精子占所有精子的百分比。
⑤、精子密度的测定：
A、用Macro Chamber计数：直接将液化后精液10μl加入Macro Chamber载玻片上，轻轻盖上盖玻片，注意不要产生气泡。静置一分钟后，在200倍显微镜下计数十个格子内有完整结构的精子，计数结果直接×106／ml,即为精子密度。如果一个精子位于相邻两格分界线上，只计数位于方格上界和左界的精子。
B、 用血细胞计数板计数：取20 μl液化后精液加入0.38ml精子稀释液，混匀。用一滴水湿润手指，轻轻湿润计数池的两侧，确保盖玻片紧贴在血细胞计数板上。向血细胞计数板的上下两个计数池分别注入约10ul充分混匀后的稀释精液，静置5分钟，在400倍显微镜下计数中央5个大方格中有完整结构的精子，计数结果直接×106／ml即为精子密度。如果一个精子在相邻两格分界线上，只计数位于方格上界和左界的精子。
⑥、非精子细胞成分：精液中非精子细胞成分( 统称“圆细胞”)，包括泌尿生殖道的上皮细胞、前列腺细胞、生精细胞和白细胞。正常精液圆细胞数应 <5×106／ml；白细胞应<1×106／ml。
7、精子形态检查
①制片：从新鲜精液中涂双份片子，注意玻片要彻底洗干净，并用70％酒精洗涤后干燥，滴一小滴( 5~20μl )于玻片上，如果精子密度超过20×106／ml，取5 μl精液；如果精子密度小于20×10／ml，，应取10~20μl精液。涂片采取“拉薄”技术：用第二张玻片的边缘在清洁的玻片表面拖拉一滴精液。注意涂片不宜太厚。当精液粘稠时，可滴一滴精液于一张玻片中央，然后将第二张玻片表面朝下盖在其上，以使精液在两张玻片之间扩散，再轻拉使两玻片分开即可得到两张片子。
② 染色：
Diff—Quik精子形态快速染色方法(试剂盒)。 A、将A液滴在玻片上15秒。
B、将玻片直立于吸水纸上出去多余的液体。 C、将B液滴在玻片上10秒。 D、将C液滴在玻片上5-10秒。
- 33 -
6
E、将玻片直立于吸水纸上去除多余液体。 F、自来水下冲洗。 G、自然干燥。 H、显微镜下观察。
③观察：染色后精子头部顶体区呈淡蓝色，顶体后区呈深蓝色，体尾部呈淡红色。胞质小滴位于头部后面或中段周围，呈淡红色。
④形态分类：采用Krllger严格标准分类，只有头、颈、中段和尾部都正常的精子才被认为是正常形态精子。正常形态精子：头部的形状呈椭圆形，长4～5μm，宽2.5～3.5μm，长宽比为1.5～1.75之间；顶体的界限清晰，占头部的40％-70％；中段细，宽度<1μm，大约为头部长度的1.5倍，并且在轴线上紧贴头部；胞浆小滴小于正常头部大小的一半；尾部直、均一，较中段细，长度约45μm 。所有形态学处于临界状态的精子均列为异常。
四、外科取精术
1、适应症：
（1） 多次精液常规检查示精液中无精子，需检查生精功能的患者。 （2） 梗阻性无精或取精极度困难患者行ICSI助孕的取精准备。 2、禁忌症：
（1） 急性生殖系统炎症或慢性炎症急性发作。 （2） 体温大于38℃者。 3、术前准备：
告知患者手术的目的及可能伴有出血、感染、血肿、部分器官功能损害等并发症。少数病人因无法从附睾中取出精子还需行经皮睾丸细针穿刺取精术。签署知情同意书，做好手术器械准备。
4、手术步骤：
（1）经皮附睾精子抽吸术（PESA）：
患者取截石位，用碘伏常规消毒手术区域，铺无菌孔巾，以2%利多卡因5ml行手术侧精索阻滞麻醉后，用7号输液头皮针连10ml注射器吸取精子培养液
- 34 -
( spermrinse)1ml。左手固定手术侧睾丸和附睾，右手握头皮针经皮穿刺附睾，由助手抽吸10ml注射器，反复抽吸，一边穿刺一边抽吸，直至针头端有淡黄浑浊附睾液体抽出。如果未见液体抽出，则改变头皮针方向多点穿刺，重复上述抽吸步骤。如果是诊断性穿刺，则只需将抽吸的附睾液涂片，显微镜下观察是否有运动的精子即可；如果是行ICSI需要取精，则将抽吸的附睾液全部注入小培养皿，在倒置显微镜下寻找活动的精子，如发现有精子，将抽吸的液体在1500 rpm/min离心10分钟，取沉渣，寻找精子于取卵当天下午进行ICSI。如提取中无精子或无活动精子则行重复穿刺或行对侧附睾穿刺，如仍无精子，则考虑行经皮睾丸细针穿刺取精术。
（2）经皮睾丸精子抽吸术（TESA）。
手术步骤：体位、消毒及麻醉方法同（PESA），用7号输液头皮针连10ml注射器吸取 Gamete 液1ml。左手固定手术侧睾丸，右手握头皮针避开皮肤血管刺入睾丸内，由助手抽吸10ml注射器，保持注射器内负压，穿刺针在睾丸内反复运动，直到淡黄色的液体流出或出现血性液体，小心拔出穿刺针，将针尖带出的曲细精管用小蚊式钳夹出一同将抽吸液全部放入小培养皿，在解剖显微镜下用2支1ml注射器针头撕碎曲细精管，然后用吸管吹打均匀并吸入离心管，放培养箱中孵育一段时间让成熟活动精子游出，去除大块组织，将混悬液在1500 rpm/min离心10分钟，取沉渣寻找成熟活动精子进行ICSI。如为诊断性穿刺则将曲细精管撕碎后迅速置倒置显微镜下寻找有没有精子。如没发现精子，则考虑行多点法穿刺再检测，方可得出结论。
5、注意事项：
（1）穿刺应避开阴囊、精索血管。
（2）睾丸穿刺针不应沿长轴穿过睾丸，以免损伤睾丸小叶结构。
（3）若抽吸出的液体性质不明，立即更换穿刺针及针筒，穿出物送细胞学检查。每更换穿刺部位，应更换穿刺针及针筒。
（4）术后留观2小时，当天避免剧烈活动，术后服用3天的抗生素，2星期内避免性生活。
- 35 -