16S rDNA鉴定细菌的方法
细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：
1.提取细菌基因组DNA,
2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离
4.胶回收目的片段
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树
试剂：
1.1 培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复
杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml,
60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高
pH大约下降0.03个单位。(Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃） 50ml 0.1mol/LTris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。Tris缓冲液
不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)
1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA 2H2O，用NaOH调pH至8.0
（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。(配置方法
1. 称取186.1g Na2EDTA 2H2O，置于1L烧杯中。 2. 加入约800mL的去离子水，
充分搅拌。 3. 用NaOH调节pH值值8.0（约20g NaOH）。 注意：pH值至8.0
时，EDTA才能 溶解。 4. 加去离子水将溶液定容至1L。 5. 适量分成小份后，
高温高压灭菌。6. 室温保存。 ）
1.4 10×TE Buffer(缓冲液）(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，
10 mM EDTA。1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）
取20ml。高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS（W/V）：称10gSDS，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温
保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷
基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl
平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓
储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。
11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA
(pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。