1.2 将加A尾巴的PCR产物与T载体连接
常用的T载体有Invitrogen的T载体；Promege的pGEM-T和TaKaRa的pMD18-T。
1.3 将载体与目的片断的连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中进行液体摇床培养，涂平板进行蓝白斑挑选。
1.4 对挑选的菌落提质粒，电泳检测大小，对正确的阳性克隆的质粒进行酶切目的片断回收。
目前对于T-A克隆技可以通过T-A克隆试剂盒来完成。
细菌16S rDNA鉴定是应注意的问题和常见问题
1 细胞裂解注意事项
1.1材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低
1.2选择适当的裂解处理方式
1.3高温温浴室定时轻柔震荡
2 核酸分离纯化
2.1采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系。
2.2采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。
2.3 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。
2.4针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。
3 核酸沉淀、溶解
3.1当沉淀的时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分。
3.2沉淀是加入1/10体积的NaAc(PH5.2,3M)，有利于充分沉淀。
3.3沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等。
3.4晾干DNA，让乙醇充分挥发。
3.5若长期储存建议用TE缓冲液溶解，TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase，TE缓冲液PH8.0可以防止DNA发生酸解。
4 DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应
4.1 DNA中含有蛋白，多糖，多酚类杂质：应重新纯化DNA，去除杂质。
4.2 DNA在溶解前有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应：应重新沉淀DNA，让酒精充分挥发。
4.3 DNA中残留有金属离子：应增加70%乙醇的洗涤次数（2-3次）。
5 DNA提取量少
5.1 实验材料不佳或量少：应尽量选择新鲜的材料。
5.2 破壁或裂解不充分：G+菌裂解前应先用生物酶或机械方式破壁；高温裂解时，时间适当延长
5.3 沉淀不完全：低温沉淀，延长沉淀时间；加辅助物促进沉淀。
5.4 洗涤DNA时丢失：洗涤时最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。
6 DNA降解
6.1 未很好的抑制内源核酸酶的活性：可增加裂解液中螯合剂的含量。
6.2 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断：细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。
6.3 外源核酸酶污染：所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。
6.4 反复冻融：将DNA分装，保存于缓冲液中，避免反复冻融。
7 反应体系对PCR扩增的影响
7.1 DNA模板：