8.0452
5. 精密度实验
准确吸取标准品溶液0.2mL,分别置5只10mL容量瓶中,按标准曲线项下操作,测定吸收度,计算相对标准差(RSD)为2.6%. 6. 加样回收率实验
准确吸取0.1,0.2,0.2,0.2,0.1mL标准品溶液于5只l0mL容量瓶中,再分别准确加入样品液0.3mL,照标准曲线制备项下操作,计算加样回收率,结果见表28—3.
表28—3 加样回收率实验 1 2 3 4 5
平均RSD/%
加标准品质量/μg 1.04 2.08 1.04 2.08 2.08
0.3mL样品中相当 金雀黄素的量/μg 2.4149 2.4149 2.4149 2.4149 2.4149 OD值 0.3665 0.4965 0.4932 0.4988 0.3625
测得相当金雀 黄素的含量/μg 3.4679 4.4921 4.4663 4.5046 3.4489 回收率/% 101.25 99.87
98.63 100.47 99.08
平均回收率/% 99.86 1.06
7. 结果计算
样品中大豆总异黄酮的百分含量(以金雀异黄素计算)按稀释度和金雀异黄素标准曲线的相应量计算. 8. 注释
若受试物为大豆的制品,如水豆腐,干豆腐,豆芽,豆豉等可采用食品粉碎机破碎后冷冻干燥,分别取干重为l0g的受试样品置于锥形瓶中,加入石油醚50mL,放置24h,过滤,残渣用滤纸筒包好,置于水浴上的索氏提取器中用甲醇提取6h,注意温度低于70℃.提取液回收甲醇,残渣上大孔吸附树脂柱,用水洗脱除去糖类成分,续以95%的乙醇洗脱,将乙醇洗脱液浓缩,干燥,以95%乙醇定容为25mL.豆浆,豆汁等液体大豆饮品可在60℃水浴上蒸干,取干重为10g的干燥物与干燥后的水豆腐等一样处理,得到不同的样品95%乙醇溶液. 二,大豆异黄酮的测定方法(高效液相色谱法) 本方法适用于大豆制品中大豆异黄酮的测定.
本方法大豆异黄酮染料木素的最低检出限为10ng;大豆苷元的最低检出限为30ng.
1. 方法提要
大豆异黄酮(soybean isoflavones,简称ISO)是一类从大豆中分离提取的具有抗氧化,抗肿瘤,改善心血管功能的主要活性成分.目前发现的大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型的糖苷两类共有12种,染料本素(Genistein,G)和大豆苷元(Daidzeiu,D)是其中两种重要化合物.本法用80%乙醇作为溶剂,提取样品中的染料木素,大豆苷元,以反相高效液相色谱分离,在紫外检测器260nm条件下检测其峰面积,以染料木素和大豆苷元两项含量之和计算大豆异黄酮含量. 2. 仪器
(1)LC高效液相色谱仪,C—RIB色谱处理机. (2)检测器:SPD—2AS紫外检测器. (3)离心机.
(4)超声波振荡器. 3. 试剂
(1)甲醇(色谱纯). (2)乙醇(优级纯). (3)双重蒸馏水.
(4)大豆异黄酮标准品:染料木素与大豆苷元标准品(美国Sigma公司产品),以染料木素的大豆苷元两项之和作为大豆异黄酮含量计算.
(5)大豆异黄酮标准溶液:准确称取染料木素标准品5.0mg,大豆苷元标准品
3.2mg,各自用流动相\甲醇+水(60+40)\定容至100mL,配制成50μg/mL的染料木素和32μg/mL的大豆苷元标准溶液. 4. 测定步骤 (1)样品处理:
a. 固体样品:准确称取一定量固体粉末样品于100mL容量瓶中,定量加入80%乙醇,经超声振荡5min,加水补足至刻度,待提取液略澄清后经离心分离(3000r/min,5min),取上清液经0.45μm滤膜过滤后待进样.
b. 液体样品:准确吸取2.0mL液体样品,加入80%乙醇摇匀并定容100mL,澄清后同上述步骤.
(2)色谱分离条件:
色 谱 柱:Shim—Pack CLC—ODS,6mm× l50mm,5μm. 流 动 相:甲醇+水(60+40),临用前用超声波除气.
流 速:0～5min,为1.0mL/min;5～10min为1.6mL/min. 柱 温:40℃.
检测波长:UV260nm. 灵 敏 度:0.016AUFS. 进 样 量:l0μL.
(3)样品测定:准确称取样品处理液和标准液各l0μL(或相同体积)注入高效液相色谱仪进行分离,以其标准溶液峰的保留时间进行定性,利用峰面积求出样液中待测物质的含量. 5. 结果计算
式中 X——样品中染料木素/大豆苷元的含量(μg/g); S1——样品峰面积;
c ——标准溶液浓度(μg/mL); S2——标准溶液峰面积; V——样品定容体积(mL); m ——试样质量(g).
样品中大豆异黄酮含量X(μg/g)=Xg+Xd(Xg,Xd分别为样品中染料木素及大豆苷元的含量) 6. 注释
(1)本法染料木素浓度在0.01～0.1mg/mL范围内呈直线关系,相关系数为0.9996;大豆苷元浓度在0.003～0.03mg/mL范围内呈直线关系,相关系数0.9945.
(2)精密度:同一样品依本法重复6次,染料木素,大豆苷元的相对标准差(RSD)分别为3.1%及1.2%.
(3)回收率:依本法各取试样9份,每3份为一组,分别加入不同量标准品进行试样处理,染料木素添加回收率为95.0%～103.7%,大豆苷元添加回收率为95.8%～105.5%.
第三节 总皂苷的测定方法(分光光度法) 本方法适用于功能性食品中总皂苷的测定. 本方法人参皂苷Re的最低检出量为2μg/mL. 一,方法提要
样品中总皂苷经提取,PT—大孔吸附树脂柱预分离后,在酸性条件下,香草醛与人参皂苷生成有色化合物,以人参皂苷Re为对照品,于560nm处比色测定. 二,仪器
1.722分光光度计.
2.PT—大孔吸附树脂柱(河北省津杨滤材厂). 3.超声波振荡器. 三,试剂
1.甲醇(分析纯). 2.乙醇(分析纯).
3.人参皂苷Re标准品(中国药品生物制品检定所).
4.5%香草醛溶液:称取5g香草醛,加冰乙酸溶解并定容至l00mL. 5.高氯酸(分析纯). 6.冰乙酸(分析纯).
7.人参皂苷Re标准溶液:精确称取人参皂苷Re标准品20.0mg,用甲醇溶解并定容至10mL,即每1mL含人参皂苷Re2.0mg. 8.重蒸水. 四,测定步骤 1.样品处理: (1)固体样品
称取1.0g左右样品于100mL烧杯中,加入20～40mL 85%乙醇,超声波振荡30min,再定容至50mL,摇匀,放置,吸取上清液1.0mL挥干后以水溶解残渣,进行柱分离. (2)液体样品
含乙醇的酒类样品:准确吸取1.0mL样品放于蒸发皿中,蒸干,用水溶解残渣,用此液进行柱层析;非乙醇类液体样品:准确吸取1.0mL样品(如浓度高或颜色深,需稀释一定体积后再取1.0mL)直接进行柱分离. 2.柱层析
以PT—大孔吸附树脂柱进行层析分离,准确吸取上述已处理好的样品溶液1.0mL上柱,用15mL水洗柱,以洗去糖分等水溶性杂质,弃去洗脱液,再用20mL85%乙醇洗脱总皂苷,收集洗脱液于蒸发皿中,于水浴上蒸干,以此作显色用. 3显色
在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL 5%香草醛冰乙酸溶液,转动蒸发皿,使残渣溶解,再加0.8mL高氯酸,混匀后移入l0mL比色管中,塞紧盖子于60℃以下水浴上加温15min取出,冷却后准确加入冰乙酸5.0mL,摇匀后以1.0cm比色皿,于560nm处与人参皂苷Re标准管同时比色. 4标准曲线的绘制:
吸取人参皂苷Re标准溶液(2.0mg/mL)0,20,40,60,80,100μL(相当于人参皂苷Re0,40,80,120,160,200μg),于10mL比色管中,用氮气吹干,同4.(3)显色步骤测定吸光度.并绘制标准曲线.
人参总皂苷浓度为20～200μg/mL之间与吸光度值呈线性关系,相关系数(r)0.999. 五,结果计算
式中 X——样品中总皂苷(以人参皂苷Re计)(g/kg或g/L); m——试样质量或试液体积(g或mL); V1——样品提取液总体积(mL); V2——样品提取液测定用体积(mL);
m1——从标准曲线查得待测液中人参皂苷Re量(μg). 六,注释
1.人参系五加科植物是人参Panax ginseng C A Meyer的根,含有多种人参皂苷(ginsenoside),多数为达玛烷型皂苷,如人参皂苷Ral,Ra2,Rbl,Rb2,Rb3,Re,Rd等;少数为齐墩果酸型(C型)皂苷,如人参皂苷Re.由于苷元不同,达玛烷型皂苷又分为:20S—原人参二醇类皂苷(A型)和20S—原人参三醇类皂苷(B型).其中,A
型和B型皂苷酸水解后,分别得到人参二醇(Panaxadial)和人参三醇
(panaxatriol).除人参外,五加科的西洋参,三七,刺人参,刺五加和葫芦科的绞股蓝中亦含有与人参皂苷类似的化合物.当保健食品原料配方中含有上述多种原料时,即以本法\总皂苷(以人参皂苷Re计)\报告检测结果.
2.对于人参,西洋参,绞股蓝纯品或以其为主要原料加工的保健食品,按《中华人民共和国药典》2000年版一部第99页,以薄层色谱法进行鉴定试验,将受试品色谱与对照药材色谱及对照品色谱进行比较确定其主要原料后,人参,西洋参制品仍以人参皂苷Re为对照品进行检测,而绞股蓝制品以绞股蓝总皂苷(中国药品生物制品检定所)为对照品进行检测,分别以\人参总皂苷\西洋参总皂苷\绞股蓝总皂苷\报告检测结果. 3.回收率:90%～105%.
第四节 褪黑素的测定方法(高效液相色谱法)
本方法适用于功能性食品中褪黑素片剂的测定,非添加褪黑素的天然食品可参照此法.
本方法褪黑素的最低检出量为25ng. 一,方法提要
样品中的褪黑素用甲醇提取后,经高效液相色谱分离,在紫外检测器上检测,波长260mm,用外标法定量,根据峰面积值计算样品中褪黑素的含量. 二,仪器
1.高效液相色谱仪(Waters2690型)带996型紫外线检测器. 2.超声波振荡器
3.离心机(5000r/min).
4.微孔过滤器(滤膜0.5μm) 三,试剂
1.甲醇(色谱纯,含量>99.9%). 2.水(超纯水)
3.褪黑素标准品(纯度99.9%以上).
4.褪黑素标准溶液:准确称取10mg褪黑素标准品于10mL容量瓶中,用甲醇定容.然后放置超声波振荡器中充分溶解,浓度为1.000mg/mL.用移液管准确移取上述溶液5mL于10mL容量瓶,配制成浓度为0.500mg/mL的标准液.采用相同步骤分别配制浓度为0.250,0.125,0.063mg/mL的标准液. 四,测定步骤 1.样品处理
取一片样品(标示含1mg褪黑素),放入小乳钵中研磨成粉末状后倒入5mL离心管中,用甲醇冲洗乳钵3次,倒入离心管中,并定容至刻度.混匀后放入超声波振荡器中萃取10min,然后离心10min(5000r/min),把上清液移至5mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度.混匀后经0.5μm微滤膜加压过滤,滤液待上机测定. 2.色谱分离条件
色谱柱:Nova—PakC18柱3.9mm×l50mm. 流动相:甲醇+水(1+1). 波 长:260nm
流 速:1.0mL/min 进 样 量:10μL
3.标准曲线的绘制,将配制成的褪黑素标准液