作曲线.
2.样品液制备及硒的测定.
称取1～2g粉碎样品,放50mL凯氏消化瓶中,加硝酸-硫酸(2:1)10mL,在砂浴或电炉上消化至溶液呈现亮绿色,冷却,转移到50mL容量瓶中,加蒸馏水至刻度,混匀.取样品液5~10mL(依硒含量而异)置于反应瓶中,加1mL 200g/L亚铁氰化钾溶液及15mL 5mol/L盐酸,加蒸馏水至30mL,接好发生装置,通气3～4min后,再接上吸收管,从筒形加液漏斗中加入KBH4溶解20mL,按制备标准曲线操作,盖上塞子,(通氮气/或用给气球打气)加压,缓缓开启活塞,把KBH4溶液加入反应瓶中,加完后,鼓气约1min,15min后在508nm下,以试剂空白作参比测定样品液光密度.查标准曲线即可计算出样品中硒含量. 五,结果计算 A×50 Y= ×100 V×m 式中:
Y:样品中硒含量(μg/100g);
A:查标准曲线得样品测定液中硒量(μg); V:用于测定的样品液体积(mL); m:样品质量(g). 六,注释
1.精细地消化样品是准确测定微量硒的关键所在,若消化不到终点则结果偏高,加热时间过长,或温度太高又会造成硒的逸失(温度控制在100℃左右).一般以溶液呈现亮绿色为宜.
2.大部分离子不干扰硒的测定,Cu++和大于1000μgFe+++的干扰可直接在反应瓶中加入K4Fe(CN)6溶液,使它们生成沉淀而掩蔽;Ag+可以在处理样品时加入NaCl溶液使之沉淀,过滤除去,I-,S2+,S2O2-3,SCN-有较严重干扰,但可在样品消化处理时除去,反应液中存在硝酸,硫酸时不干扰硒的测定.
3.反应液中KBH4量在0.4～0.7g时,吸收值有较稳定的量高值.吸收完后,于25℃室温下放置15min颜色达到稳定,24h不变. 第二十三节 有机锗含量的测定方法(分光光度法) 一,方法提要
用混酸(发烟硝酸+浓硫酸)回流消化,或用干灰化法(600～650℃灰化完全)灰化样品,Fe(OH)3共沉淀富集锗,苯基荧光酮-溴化十六烷基三甲按(CTMAB)胶束增溶分光光度法测定锗含量.本法灵敏度高,检出限为198ng/g,方法操作简便,精密度好. 二,仪器
751紫外可见分光光计. 酸度计. 磁力搅拌器.
样品消化装置,玻璃设备等. 三,试剂 H2SO4. HCl.
Fe2(SO4)3.
H2O2. CCl4.
发烟硝酸.
GeO2(光谱纯).
8. 0.03%苯基荧光酮(CTMAB):称0.03g溶于50mL无水乙醇中,加5mL 1.5mol/L H2SO4lmL,再加去离子水定容至100mL. 9. 0.9%CTMAB:0.9gCTMAB溶于去离子水中,加9mol/L H2SO4lmL,再加去离子水定容至100mL. 四,测定步骤 1.样品液的制备
称取粉碎样品3.0g,置250mL圆底消化瓶中,加混酸(5ml浓硫酸,15ml发烟硝酸)小火回流消化至不冒NO2烟雾,消化液呈淡黄色,如试样难消化,可补加发烟硝酸3～5mL继续消化.将消化液冷至室温,加5mLH2O2酶(30%),小火加热,反应完毕后,即消化液呈透明无色,冷至室温.完全转移至烧杯中,于冰浴中,滴加饱和NaOH中和至pH2～4,加10mL3.8t2(SO4)3,于中和液中,在pH计控制磁力搅拌下,用稀NaOH溶液调pH至7.5,此时铁与锗一起共沉淀,继续搅拌5min使沉淀完
全,2000r/min 离心10min,弃上清液得共沉淀物.将沉淀物用少量3mol/L HC1溶解,并完全转移到125mL分液漏斗中,加浓HC1使HC1浓度为9mol/L,充分摇匀后用10mL CCl4萃取2次,合并CCl4层萃取液,以9mol/LHCL洗涤,除掉上层洗液.准确移取10.0mL去离子水于CCl4层中进行反萃取. 2. 工作曲线制备
准确称取0.1400g GeO2(光谱纯,称前于110℃干燥2h),制备成5μg/mL的锗标准液.准确称取不同量标准液(0～ 0.5μg/mL),于10mL试管中,均加去离子水至5mL,加0.03%苯基荧光酮2mL,0.9%CTMAB 1.5m L,9moL/L H2SO41mL,混匀,补加去离子水至刻度.放置10min后于514nm测定吸光度.以锗的不同浓度与对应的吸光度制作工作曲线. 3. 样品液测定
精确吸取5mL水层萃取液放入10mL带塞试管中,同工作曲线操作加苯基荧光酮,CTMAB,H2SO4及测定吸光度. 五,结果计算
由工作曲线查得样品液中锗含量(μg/mL): ρ×V
样品中锗含量(μg/g)= m 式中:
m:样品质量(g);
ρ:查工作曲线得样品液中锗含量(μg/mL); V:样品液体积(mL).
第二十四节 茶多酚含量的测定方法(高锰酸钾直接滴定法) 一,方法提要
茶叶茶多酚易溶于热水中,在用靛红作指示剂的情况下,样液中能被高锰酸钾氧化的物质基本上都属于茶多酚类物质.根据消耗1mL 0.318g/100mL的高锰酸钾相当于5.82mg茶多酚的换算常数,计算出茶多酚的含量. 二,仪器
分析天平. 电热水浴锅. 真空泵. 电动搅拌机.
250mL抽滤瓶(附65mm细孔漏斗). 500mL有柄白瓷皿. 100mL容量瓶. 5mL胖肚吸管等. 三,试剂
1. 0.1%靛红溶液:称取靛红(G.R.)1g加入少量水搅匀后,再慢慢加入相对密度1.84的浓硫酸50mL,冷后用蒸馏水衡释至1000mL.如果靛红不纯,滴定终点将会不敏锐,可用下法磺化处理:称取靛红1g,加浓硫酸50mL,在80℃烘箱或水浴中磺化4～6h,用蒸馏水定容至1000mL,过滤后贮存于棕色试剂瓶中.
2. 0.630%草酸溶液:准确称取草酸(H2C2O4·2H2O)6.3034g,用蒸馏水溶解后定容至1000mL. 3. 0.127%高锰酸钾溶液的配制及标定:称取AR的 KMO41.27g,用蒸馏水溶解后定容至1000mL,按下面方法标定.
准确吸取0.630%草酸10mL放在250mL三角瓶中(重复2份),加入蒸馏水50mL,再加入浓硫酸(相对密度1.84)10mL,摇匀,在70～80℃水浴中保温5min,取出后用已配好的高锰酸钾溶液进行滴定.开始慢滴,待红色消失后再滴第2滴,以后可逐渐加快,边滴连摇动,待溶液出现淡红色保持1min不变即为终点(约需25mL左右).按下式计算高锰酸钾的当量数(1mL0.630%草酸消耗2.5 mL0.127%高锰酸钾). 10×0.630%=耗用KMnO4毫升数×ω 10×0.63
ω(KMnO4浓度,%)= KMnO4毫升数 四,测定步骤 1.供试液的制备
准确称取茶叶磨碎样品1g,放在200mL三角烧瓶中,加入沸蒸馏水8mL ,在沸水浴中浸提30min,然后过滤,洗涤,滤液倒入100mL,容量瓶中,冷至室温,最后用蒸馏水定容至100mL刻度,摇匀,即为供试液. 2.测定
取200mL蒸馏水放在有柄瓷皿中,加入0.1%靛红溶液5mL,再加入供试液5mL.开动搅拌器,用已标定的KMnO4溶液进行连搅拌边滴定,滴定速度不宜太快,一般以1s1滴为宜,接近滴定终点时再应慢滴.滴定溶液由深蓝色转变为亮黄色为止,记下消耗高锰酸钾的毫升数为A值.为避免视觉误差,应重复二次滴定取其平均值,然后用蒸馏水代替试液,做靛红空白滴定,所耗用高锰酸钾的毫升数为B值. 五,结果计算
茶多酚含量(%)=(A-B)×ω ×0.00582×100/(0.318×m ×V / T)
式中:
A:样品液消耗KMnO4量(mL); B:空白液消耗KMnO4量(mL);
ω:KMnO4浓度(%); m:样品质量(g);
V:吸取样品液量(mL); T:提取样品液量(mL). 六,注释
配制好的高锰酸钾溶液必须避光保存,使用前需重新标定.一般情况下,一星期标定一次.
2. 滴定终点的掌握上以出现亮黄色为止,溶液颜色的变化是由蓝变绿,由绿逐渐变黄.在观察时,以绿色的感觉消失开始出现亮黄为终点.红茶的终点颜色稍深(土黄色),绿茶的终点颜色稍浅(浅黄色).
3. 制备好的供试液不宜久放,否则引起茶多酚自动氧化,测定数值将会偏低. 第二十五节 儿茶素含量的测定方法(香荚兰素比色法) 一,方法提要
儿茶素和香荚兰素在强酸性条件下生成橘红到紫红色的产物,红色的深浅和儿茶素的量呈一定的比例关系.该反应不受花青甙和黄酮甙的干扰,在某种程度上可以说,香荚兰素是儿茶的特异显色剂,而且显色灵敏度高,最低检出量可达0.5μg. 二,仪器
1. 10μL或50μL的微量注射器. 10~15mL具塞刻度试管. 分光光度计. 三,试剂
95%乙醇(A.R.). 盐酸(G.R.).
3. 1%香荚兰素盐酸溶液:1g香荚兰素溶于100mL浓盐酸(G.R.)中,配制好的溶液呈淡黄色,如发现变红,变蓝绿色者均属变质不宜采用.该试剂配好后置冰箱中可用1天,不耐贮存,宜随配随用. 四,测定步骤
称取1.00g~5.00g磨碎干样(一般绿茶用1.00g,红茶用2.00g)加95%乙醇20mL,在水浴上提取30min,提取过程中要保持乙醇的微沸,提取完毕进行过滤.滤液冷后加95%乙醇定容至25mL为供试液.
吸取10μL或20μL供试液,加入装有1mL95%乙醇的刻度试管中,摇匀,再加入1%香荚兰素盐酸溶液5mL,加塞后摇匀显出红色,放置40min后,立即进行比色测定消光度(E),另以1mL95%乙醇加香荚兰素盐酸溶液作为空白对照.比色测定时,选用500nm浓长,0.5cm比色杯(如用1cm比色杯进行测定,必须将测得的消光度除以2,折算成相当于0.5cm比色杯的测定值,才能进行计算含量). 五,结果计算
当测定消光值等于1.00时,被测液的儿茶素含量为145.68μg,因此测得的任一消光度只要乘以145.68,即得被测液中儿茶素的微克数.按下式计算儿茶素总含量.
E×145.68 V总
儿茶素总量(mg/g)= × 1000 V×m 式中:
E:样品光密度;
V总:样品总溶液量(mL); V:吸取的样液量(mL); m:样品质量(g). 思考题
熟悉低聚糖,大豆异黄酮,总皂苷,褪黑素,肉碱,EPA和DHA,免疫球蛋白IgG,超氧化物歧化酶,总谷胱甘肽,大蒜辣素,核苷酸,糖精,牛磺酸,甘草苷,膳食纤维,枸杞子多糖,香菇多糖,磷脂,花生四烯酸,β-胡萝卜素,维生素E和胡萝卡素,微量硒,有机锗,茶多酚,儿茶素含量的测定方法. 参考文献
1 McCord J M,Fridovich I,Superoxide dismutase;An enzymic function for erythrocuprein (bemocuprein).J Biol Chem,1969,244:6049~6055
2 Beauchamp C,Fridovich I,Superoxide dismutase;Improved assays and an assay applicable to acrylamide gels.Anal Biochem,1971,44:276~287 3邓碧玉,袁勤生,李文杰.改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方法.生物化学与生物物理进展,1991,18(2):163
4 邹国林,桂兴芬,钟晓凌,朱汝蹯.一种SOD的测活方法——邻苯三酚自氧化法的改进.生物化学与生物物理进展,1986,(4):71~73
5 王光亚.保健食品功效成分检测方法.北京:中国轻工业出版社,2002
6 何照范,张迪清.保健食品化学及其检测技术. 北京:中国轻工业出版社,2002 m1×V1×100 m×V2×100 m1×100 m× ×1000