离心机. 分光光度计 pH计. 3.试剂
(1)磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O),磷酸二氢钾(KH2PO4),甲硫氨酸(Met),氮蓝四唑(NBT),核黄素,乙二胺四乙酸(EDTA),以上试剂均为分析纯级;所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水.
(2)pH7.8,5.0×10-2mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲液(于冰箱中保存) 4.测定步骤
(1)酶液的制备:称取5—10g样品,加预先在冰箱中放置的上述K2HP04—KH2PO 4缓冲液,缓冲液的量为所用样品的10倍以上,在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆,四层纱布过滤,滤液经4000r/min离心20min,取上清液用于酶活测定.
(2)酶反应体系液的制备:取上述K2HPO4—KH2PO4缓冲液30mL,依次溶入Met,NBT,核黄素与EDTA,使它们的浓度分别为1.3X10-2mol/L,6.3 10-5mol/L,1.3× 10- 6mol/L与1×10-4mol/L,放冰箱中避光保存.
(3)测酶活在暗光下,取上述酶反应体系液3mL,移人试管中,试管放在一反应小室中,反应小室壁上贴锡箔纸,应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置.向每支试管加入25～30m L酶液.在25~30℃下用光强40001x的荧光灯管(可用15W荧光灯)进行光照,15~20min后,出现颜色变化,停止光照.在560nm波长下比色测量透光度.用未加酶液的反应体系做对照. 5.结果计算
以抑制蓝色形成的50%为一个酶活单位.按下式计算: 样品酶活单位=
式中s——样品照光后的透光度; a——未加酶之反应液照光后透光度; b——未加酶之反应液照光前透光度; n——酶液稀释倍数.
样品酶活单位表示,SOD酶活单位(U)/g干重(g 鲜重或g蛋白). 6.注释
(1)进行照光操作时,应注意所用试管的直径与管壁厚度基本一致. (2)进行比色测定时,应用未加核黄素的酶反应体系液作空白. 二,连苯三酚自氧化法
连苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O,生成带色的中间产物.在自氧化过程的初始阶段,黄色中间物的积累在滞后30~45s后就与时间成线性关系.中间产物在420nm处有强烈的光吸收,在有SOD存在时由于它能催化生成 O生成O2与H2O2,从而阻止了中间物的积累,通过计算就可以求出SOD的活力. 2.仪器
紫外分光光度计. pH计. 3.试剂.
(1)连苯三酚,K2HPO4·3H2O,KH2PO4,HCL,均为分析纯级;所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水.
(2)连苯三酚液:用1×10-2mol/L HCL将之配成浓度5×10-2mol/L连苯三酚液. (3)pH8.3,5×10-2mol/LK2HPO4 -KH2PO4缓冲液.
4.测定步骤
(1)酶液的制备,除使用以上K2HPO4 -KH2PO4缓冲外,其他同氮蓝四唑法.
(2)连苯三酚自氧化速率的测定:取4.5mL pH8.3,5×10-2mol/L K2HPO4 -KH2PO4缓冲液,在25℃水浴中保温15min,加入10μL5×10-2mol/L连苯三酚液,迅速摇匀(空白以K2HPO4-KH2PO4缓冲液代替),倒入光径1cm的比色杯内,在420nm波长下于恒温池中每隔30s测A值一次.计算线形范围内每1minA的增值,此即为连苯三酚的自氧化速率,要求自氧化速率控制在0.070OD/min左右.
(3)酶活测定:测定方法与测连苯一酚自氧化速率相同,在加入连苯三酚之前,先加入待测SOD酶液,缓冲液减少相应体积.计算加酶后连苯三酚自氧化速率,按以下公式计算酶活. 5.结果计算
样品酶活单位表示同氮蓝四唑法. 样品酶活单位=
式中A420nm/min——酶样品在420nm处每分钟光密度变化值; V——反应液体积; n——酶液稀释倍数.
第九节 总谷胱甘肽(GSH)含量的测定方法(循环法) 一,方法提要
在还原性辅酶II(NADPH)和谷胱甘肽还原酶(GR)维持谷胱甘肽总量不变的条件下,GSH和DTNB反应,在此反应中,NADPH量逐渐减少,TNB量逐步增加,TNB在412nm吸收增加的速率A412/min与样品中总谷胱甘肽量呈正比.由于采用了γ-GT(γ-谷氨酸转肽酶)抑制剂(SBE抗凝剂)和快速测定,克服了血浆中谷胱甘肽含量极低,离体后消退极快,不易准确测定的困难.本法灵敏度可达0.1nmol/L左右,加收率93%-106%.由于GSH和GSSG循环交替,周而复始总量不变,故称此为循环法(Recirculating Assay),是目前较灵敏的测定总GSH(即GSH+GSSG)方法. 二,仪器
带动力学功能的分光光度计(或普通分光光度计). 高速离心机.
常规的玻璃设备等. 三,试剂
1. 0.125mol/L Na2HPO4-NaH2PO4.
2. 6.3mol/L EDTA缓冲液,pH7.5(0~4℃保存).
3. 6.0mmol/L DTNB: 23.8mg DTNB (FW 396.4) 溶于10mL上述缓冲液中(0℃以下冰冻保存).
2.1mmol/L NADPH:17.5mg NADPH(FW 833.4)溶于10mL上述缓冲液中(使用当天配制).
50u/mL谷胱甘肽还原酶(GR).
以上述缓冲液稀释商品GR至要求浓度.例如取0.260mL GR(Sigma, 500u/2.6mL)加上述缓冲液0.74mL(使用当天配制).
SBE抗凝剂(PH7.4):内含0.8mol/L l-丝氨酸. 0.8mol/L H3BO3.
0.05mol/L EDTA,以浓NaOH调pH至7.4(室温存放). 10%TCA(三氯醋酸),室温存放. 0.3mol/L Na2HPO4(室温存放).
四,测定步骤 GSH标准系列 称取15.3mg GSH,用双蒸馏水准确稀释至100mL,得0.5mmol/L GSH.取此液0.08mL,加双蒸馏水1.92mL,得20nmol/L 标准液,再顺序1:1稀释制做标准曲线时,各取0.2mL,则得4,2,1,0.5,0.25nmol/L标准系列. 样品液制备
血浆:取1.5mL静脉全血迅速放入含0.09mL SBE的小离心管中混匀,即刻高速(约10000r/min)离心1.5min,取出上层血浆0.6mL,移入含0.24mL 6.0mmol/L DTNB的小管中,混匀,迅速取出0.35mL(内含0.1mL DTNB和0.25mL血浆)移入1mL比色杯中测总GSH.从取入血开始测定应控制在3min之内,大鼠,猪血1.5h内. 全血:取0.1mLSBE抗凝全血,移入含0.5mL 10%TCA小离心管中,混匀,高速离心2min,取上清液0.1mL,加入0.4mL 0.3mol/L Na2HPO4, 0.5mL上述缓冲液,混匀.取此全血制备液0.1mL移入比色杯中测总GSH.速冻组织(心,肝,肾等):约1g组织块,加5mL 10% TCA匀浆,10000r/min离心5min,取上清液0.1mL,加入0.4mL 0.3mol/L Na2HPO4, 0.5mL上述缓冲液,混匀.取此组织制备液0.1mL移入比色杯中测总GSH. GSH测定
若采用有动力学功能的分光光度计,则令条件为:波长412nm,吸收范围0~3.0,延后时间20min,反应时间2min;若为普通分光光度计,则人工定时读A412nm,计算出A412/min.总GSH测定步骤操作(见表28-4) 表28-4 总GSH测定步骤 试剂或样品 GSH标准管 样 品 管 血 浆 全 血 组 织
2.1mmol/L NADPH/mL 0.10 0.10 0.10 0.10
6.0mmol/L DTNB/mL 0.10 0.10 0.10
GSH标准系列/mL 0.20
DTNB血浆/mL 0.35
全血制备液mL 0.10
组织制备液/mL 0.10
缓冲液(pH7.5)/ mL 0.60 0.55 0.70 0.70
直接加在1mL比色杯(1cm光径)中 50u/mL GR/mL 0.01 0.01 0.01 0.01
加在比色杯壁上,比色前混匀,即刻开始读A412/min 五,结果计算
制作A412/min-nmol GSH标准曲线,从样品的A412/min计算出反应管中GSH的nmol量G.
血浆:G/ 0.25 mL = nmol GSH/mL 血浆
红细胞:G×90 / (0.1 mL×血球容积比)= nmol GSH/mL红细胞 组织:G×50/(0.1mL×匀浆组织块质量(g))= nmol GSH/g组织
第十节 大蒜辣素含量的测定方法(重量法) 一,方法提要
大蒜中蒜氨的亚砜基,大蒜辣素硫代亚砜基及其转化产物的硫醚基
(—S—,—S—S—,—S—S—S—等)被浓HNO3氧化成硫酸根离子,与氯化钡反应生成硫酸钡沉淀,用重量法测定,根据测得的硫酸钡重量换算成大蒜辣素含量. 二,仪器
高温电炉(马福炉). 组织捣碎机等. 三,试剂 浓硝酸.
1:1盐酸溶液. 5%氯化钡溶液. 0.1%甲基橙溶液.
2%硝酸银溶液(贮于棕色瓶内).
10%氢氧化钠溶液等(试剂均为A.R.). 四,测定步骤 样品液制备
取有代表性的新鲜蒜剥去皮,用组织捣碎机捣成糊状,准确称取5g,加浓硝酸2mL,用玻璃棒压磨至呈黄色,放置5min,用蒸馏水移至100mL容量瓶内,定容混匀干过滤,弃去最初数毫升滤液,取滤液80mL放入烧杯中,加甲基橙指示剂2滴,滴加10%氢氧化钠溶液至黄色,再滴加1:1盐酸至红色,并多加1mL,在砂浴上浓缩至约50mL. 沉淀
将浓缩液放电炉上热至微沸,取下加入10mL5%氯化钡溶液,搅拌均匀,在90℃水
浴中保温2h,用致密无灰滤纸过滤,以热蒸馏水洗至无氯离子(滤液加硝酸银溶液不混浊). 烘干及灰化
将沉淀连同滤纸放入已知质量的坩埚中,在低温电炉上烘干并使滤液炭化,再放入高温电炉中于600℃下灼烧30min至灰分变白,取出冷却称重. 五,结果计算
根据硫酸钡质量按下式计算: 32.06×m1×162.264×V0 大蒜辣素含量(%)= ×100 233.39×m2×V×32.06×2 式中:
32.06:硫的相对分子质量; 233.39:硫酸钡相对分子质量; 162.264:大蒜辣素相对分子质量; m1:硫酸钡质量(g); m2:样品质量(g);
V0:样品提取液总体积(mL); V:吸取提取液体积(mL).
第十一节 核苷酸含量的测定方法(HPLC法) 一,方法提要
食品中核苷酸经冷的HClO4提取,HPLC色谱阴离子柱分离,检测波长为260nm,与标准峰面积比较,进行定量测定. 二,仪器
岛津高效液相色谱仪LC-4A,SPD-2AS紫外-可见分光光度检测器.
三,试剂.标准品:5ˊ-肌苷酸钠(5ˊ-IMP),5ˊ-鸟苷酸钠(5ˊ-GMP),5ˊ-尿苷酸钠(5ˊ-UMP),5ˊ-胞苷酸钠(5ˊ-CMP),5ˊ-腺苷酸钠(5ˊ-AMP),次黄嘌呤均系日本生产,KH2PO4,HC1O4,KOH均为分析纯. 四,测定步骤 样品液制备
市售新鲜食品绞碎,混匀.称取适量放入100mL烧杯中,加入冷的5%HC1O4溶液30mL,混匀,4℃冰箱内放置1h.取出后,均质,将匀浆液移入50mL容量瓶中,用5% HC1O4溶液定容至50mL,通过滤纸过滤,取滤液5.0mL,移入10mL量瓶中,用3mol/L KOH溶液调pH至中性,以蒸馏水稀释至10mL,混匀.离心,上清液用0.45μm的水系滤膜过滤,滤液用高效液相色谱仪进行分析. 标准曲线
5ˊ-AMP,GMP,UMP,IMP均以0.10,0.20,0.30,0.40,0.50μg不同浓度的混合液分别进样,计算峰面积和含量的回归方程. 色谱条件
色谱柱:岛津LC用ISA-07/S2504离子交换柱,直径4.0mm×25cm; 柱温:60℃;
流动相:0.2mol/L KH2PO4溶液,pH4.5; 流速:1.5mL/min; 检测波长:260nm. 五,结果计算