根据样品液峰面积,由回归方程式计算出样液中各核苷酸含量,再换算成样品5ˊ-AMP等核苷酸含量(mg/100g).
第十二节 糖精含量的测定方法(比色法) 一,方法提要
糖精为白色结晶或粉末,无臭或微有酸性芳香气,味极甜.糖精与硫代二苯胺和醋酸铜作用生成很稳定的红色化合物,所呈现的色泽与糖精的含量成正比,可与标准比色定量.本法的特点:简便,快速,反应专一,颜色稳定. 二,仪器 分光光度计.
分液漏斗(250mL). 三,试剂
1. 硫代二苯胺溶液:称取1.0g硫代二苯胺,加少量无水乙醇溶解后,移入100mL容量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度.临用时配制(只能用1天). 2. 0.5%醋酸溶液.
3. 0.5%醋酸铜溶液:称取醋酸铜0.5g,加入0.5%醋酸溶液100mL. 4. 糖精钠标准贮备液:称取糖精钠100 mg,加入50%乙醇溶解后,移入100mL容量瓶中,加入50%乙醇至刻度,摇匀.1mL含糖精钠1mg. 四,测定步骤 1.样品处理
(1)不含蛋白质,脂肪的液体样品
如果汁,果露,汽水,酸梅汤,麦精露,格瓦斯,各种可口可乐,矿泉水等.首先将样品倒入烧杯中,用玻璃棒不断地搅拌除去CO2,称取25g(或25mL样品,置于125mL分液漏斗中,加入5mL10%H2SO4摇匀,用乙醚(30,10,10mL)萃取三次,每次摇3min,弃去水层,合并乙醚层.再用1%碳酸氢钠(NaHCO3)溶液萃取乙醚中的糖精,萃取二次,每次25mL,弃去乙醚层,向水层加入10mL10%盐酸溶液酸化,然后用乙醚提取三次(30,10,10mL).将乙醚提取液用100mL酸性水(pH4~6)洗涤一次,弃去水层,将乙醚层移入100mL烧杯中,于40℃左右水浴上蒸发至1mL以下,用5mL50%乙醇洗入15mm×180mm试管中,加入醋酸铜溶液和硫代二苯胺溶液各1mL,再加乙醇3mL,将试管置65~70℃水浴中50min,并不断地摇动.然后移入50mL分液漏斗中,用2mL无水乙醇洗涤试管后合并于分液漏斗中.加入5mL苯或二甲苯,再加15mL水,振摇5~10min,弃去水层.加1g无水硫酸钠脱水.以空白液为参比,用1cm比色杯,于510nm处测定消光值,从标准曲线上查出相应的浓度.按下式计算含量. (2)含酒清的液体样品
准确吸取样品10mL,加入10mL水,加4%氢氧化钠使成碱性,于沸水浴上蒸去酒精,然后移入125mL分液漏斗中,以下按(1)不含蛋白质,脂肪的液体样品操作. 2.标准曲线的绘制
准确吸取糖精钠标准贮备液1mL,置于100mL容量瓶中,加入50%乙醇稀释至刻度,摇匀.1mL含10μg糖精钠.取0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL(相当于糖精钠0,5,10,20,30,40,50μg),分别置于15mm×180mm试管中,加入醋酸铜溶液和硫代二苯胺液各1mL,以下按(1)不含蛋白质,脂肪的液体样品操作. 五,结果计算 V 1000
糖精钠(mg/kg或L)= × m 1000
式中 V:相当于糖精钠标准浓度(μg); m:样品质量(g). 六,注释
颜色反应达到最大强度时各试剂的用量为:硫代二苯胺10mg;醋酸铜5mg;0.5%醋酸1mL.
当溶液为中性或碱性,以及醋酸铜过量时,将产生沉淀. 反应时间(当70℃时)以45~50min为宜. 提取剂以二甲苯为最好,氯仿最差.
山梨酸,苯甲酸,对-羟基苯甲酸,脱氢醋酸等食品添加剂均无干扰. 第十三节 牛磺酸含量的测定方法(HPLC法) 一,方法提要
牛磺酸普遍存在于动物体内,特别是海洋生物体内,据文献报道,牛磺酸以游离形式存在,不掺入蛋白质,并具有多种生理,药理作用,常用的含量测定方法有:酸碱滴定法,荧光法,液体闪烁法,氨基酸自动分析仪法和薄层扫描法等.采用高效液相色谱2,4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生化法测定海洋生物和有关制剂中牛磺酸的含量,该方法具有操作简便,快速,准确,重现性好等特点. 二,仪器
高效液相色谱仪,紫外分光光度检测器,微处理机. 三,试剂 牛磺酸. 乙腈.
碳酸氢钠. 磷酸氢二钠.
磷酸二氢钠均为分析纯.
2,4-二硝基氟苯为生化试剂(Merck公司). 四,测定步骤 测试条件
色谱柱:4.6mm i.d.×250mm,SpherisordC-18.5μg.
流动相——A:CH3CN—H2O(1:1),B:pH7磷酸缓冲液,浓度为30%A. 检测波长:360nm. 流速:1mL/min. 纸速:0.5cm/min. 标准曲线制作
(1)精确称取牛磺酸对照品10mg,置50mL容量瓶中,加蒸馏水溶解并稀释至刻度,即得牛磺酸对照液.
(2)精密吸取对照液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL,分别置于10 mL容量瓶中,加蒸馏水使总体积均为0.5mL,然后依次各加入0.5mol/L NaHCO3(pH9)溶液lmL,1%2,4-二硝基氟苯乙腈溶液1mL.摇匀,置60℃水浴中避光加热60min后取出,加pH7磷酸盐缓冲液至刻度,摇匀,分别取4μL进样测定,以浓度为横座标,以峰面积为纵座标,进行线性回归. 样品测定.
精密称取样品2g,置25mL容量瓶中加蒸馏水然释至刻度,精密吸取0.5mL,按上述同样条件反应后取4μL进行测定. 五,结果计算
根据待测样液色谱峰面积,由标准回归方程式中得样液中牛磺酸含量,计算出样品中含量(mg/100g).
第十四,甘草苷含量的测定方法(HPLC法) 一,方法提要
甘草苷系天然甜味剂,是由甘草之根中提取出来.溶于水,乙醇中,不溶于乙醚,氯仿.采用反相离子对分配型高效液相色谱法同时测定食品中甘草苷和糖精钠甜味剂.样品溶液经预柱(Sep-pak C-18)处理后,用高效液相色谱法测定.操作简易,迅速.酱油,豆酱中甘草苷和糖精钠的添加回收率分别为99.5%和97.8%,定量限界均为0.005g/kg. 二,仪器
高效液相色谱仪. 离心机等. 三,试剂
离子对试剂:0.1mol/L十六烷基三甲基铵氯化物(CTA).
洗脱溶液:乙醇-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(1:1)用磷酸调pH为3. 5%氨水. 四,测定步骤 酱油
取试样5g,加0.1mol/L十六烷基三基铵氯化物(CTA).溶液5ml,加蒸馏水至
100ml,取此溶液20mL,通过预柱(Sep-Pak C-18)2mL/min,用10mLab蒸馏水洗涤,然后用8ml洗脱溶液洗脱,洗脱液中加0.1mol/L CTA溶液至10 mL,取其50μL进高效液相色谱仪. 豆酱,腌鱼
取试样5g,加5%氨水20mL,用组织捣碎机捣碎,加蒸馏水至50mL.时时振摇,放置1h,离心分离(3000r/min)10min,取上清液25mL于烧杯中,加0.1mol/L CTA 溶液2.5mL,用1mol/L磷酸调pH至酸性(pH3～6).加蒸馏水至50mL,离心分离,除去不溶物,取此溶液20mL.和酱油同样用预柱处理,制成试验溶液进高效液相色谱仪. 高效液相色谱条件
柱:Li Chrosorb RP-18(5μm)直径4mm×250mm,保持柱:Li Chrosorb RP-18直径4mm×4mm,流动相:乙醇-0.05mol/L磷酸二氢钠(2:3)溶液中含0.02mol/L CTA.用磷酸调pH为3.0,流动相流量:1.0mL/min,柱温:40℃,测定波长,254nm,样液注入量:50μL. 五,结果计算
根据待测样液色谱峰面积,由标准回归方程式中得样液中甘草苷含量,计算出样品中含量(mg/100g).
第十五节 膳食纤维含量的测定方法(DNF法) 一,方法提要
样品在硫酸月桂酯钠存在下,细胞内容物被溶出,洗脱后测定其残渣.该法又叫中性洗涤剂纤维素法.此法测得值包括纤维素,半纤维素,木质素的总量. 二,仪器 高温炉等. 三,试剂
1.中性洗涤剂溶液:称取30g硫酸月桂酯钠,18.61g EDTA·2Na·2H2O,6.81g硼酸钠(含10个结晶水),4.56g 磷酸氢二钠,10mL甘油单醚,加水至1L.用碳酸钠或
盐酸调pH为6.9~7.1.该液低温保存时析出结晶,可加热溶解后再用. 2.萘烷.
3.无水亚硫酸钠. 4.丙酮. 四,测定步骤
称到0.5-1.0g风干粉碎样品(一般用20-30目为宜)置于广口三角烧瓶中,加入100ml中性洗涤剂溶液,10ml萘烷,0.5g亚硫酸钠,加热回流,使之在5min内沸腾,并维持微沸60min.抽滤,开始时慢慢抽滤.用90-95℃热蒸馏水充分洗残渣,再用丙酮洗二次,风干后,于100-105℃下干燥至恒重.然后放在500℃高温炉中灰化3h,求其质量,前后质量之差即为DNF量. 五,结果计算 DNF质量(g) DNF(%)= 样品质量(g) 六,注释
脂肪含量高的样品的测定时产泡特别多,影响过滤应先脱脂.
2. 淀粉含量高的样品,煮沸后过滤困难,且淀粉中也包含DNF,使测定值偏高.一般应先用胰酶处理:取0.5g样品置于广口瓶中,加蒸馏水煮沸5min,冷却后加1/15mol/L磷酸盐缓冲液30mL(pH6.8),20mL 10g/L胰酶溶液,加氯化钠使反应时浓度达10mmol/L,再加2~3滴苯,40℃保温24h,3000r/min离心,弃去上清液残渣移入锥形瓶中,按常规测定DNF值.
第十六节 枸杞子多糖含量的测定方法(分光光度法) 一,方法提要
先用80%乙醇提取以除去单糖,低聚糖,甙类及生物碱等干扰成分,然后用蒸馏水提取其中所含的多糖类成分.多糖在硫酸作用下,水解成单糖,并迅速脱水生成糠醛衍生物,与苯酚缩合成有色化合物,用分光光度法测定其枸杞子多糖含量.本法简便,显色稳定,灵敏度高重现性好. 二,仪器
721型(或其它型)分光光度计. 三,试剂
1.葡萄糖标准液:精确称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖100mg,置100mL容量瓶中,加蒸馏水溶解并稀释至刻度.
2.苯酚液:取苯酚100g,加铝片0.1g,碳酸氢钠0.05g,蒸馏收集182℃馏分,称取此馏分10g,加蒸馏水150g,置棕色瓶中备用. 四,测定步骤
枸杞多糖的提取与精制
称取剪碎的枸杞子100g,经石油醚(60~90℃)500mL回流脱脂二次,每次2h,回收石油醚.再用80%乙醚500mL浸泡过夜,回流提取二次,每次2h.将滤渣加渣加蒸馏水3000mL,90℃热提取1h,滤液减压浓缩至300mL,用氯仿多次萃取,以除去蛋白质加活性炭1%脱色,抽滤,滤液加入95%乙醇,使含醇量达80%,静置过夜.过滤,沉淀物用无水乙醇,丙醇,乙醚多次洗涤,真空干燥,即得枸杞多糖. 标准曲线制备
吸取葡萄糖标准液10,20,40,60,80,100μL,分别置于带塞试管中,各加蒸馏水使体积为2.0mL,再加苯酚试液1.0mL,摇匀,迅速滴加浓硫酸5.0 mL,摇匀后放置
5min,置沸水浴中加热15min,取出冷却至室温;另以蒸馏水2mL,加苯酚和硫酸,同上操作做空白对照.于490nm处测吸光度,绘制标准曲线. 换算因素的测定
精确称取枸杞多糖20 mg,置100mL容量瓶中,加蒸馏水溶解并稀释至刻度(贮备液).吸取贮备液200mL,照标准曲线制备项下的方法测定吸光度,从标准曲线中求出供试液中葡萄糖的含量,按下式计算因素F=m/(ρ×D),式中m为多糖质量(μg),ρ为多糖液中葡萄糖的浓度,D为多糖的稀释因素.测得F=3.19. 4. 样品溶液的制备
精确称取样品粉末0.2g,置于圆底烧瓶中,加80%乙醇100mL回流提取1h,趁热过滤,残渣用80%乙醇洗涤(10mL×3).残渣连同滤纸置于烧瓶中,加蒸馏水100mL,加热提取1h,趁热过滤,残渣用热水洗涤(10mL×3),洗液并入滤液,放冷后移入250mL量瓶中,稀释至刻度,备用.
5. 样品中多糖含量测定.吸取适量样品液,加蒸馏水至2mL,按标准曲线制备项下方法测定吸光度.查标准曲线得样品液中葡萄糖含量(μg/mL). 五,结果计算
按下式计算样品中多糖含量: ρ×D×F
多糖含量(%)= ×100 m 式中:
ρ:样液葡萄糖浓度(μg/mL); D:样品液稀释因素; F:换算因素;
m:样品质量(μg).
第十七节 香菇多糖的测定方法(HPLC法) 一,方法提要
采用高效色谱法分析香菇多糖,选用TSK SW凝胶排斥色谱柱为分离柱,香菇样品经简单的预处理,在示差折光检测器中进行检测,以不同分子量标准右旋糖酐作标准,同时测定样品多糖的分子量分布情况及含量.该方法较其他多糖测定法具有快速,简便,准确等优点,是目前较为行之有效的测定方法. 二,仪器
高效液相色谱仪,包括126双溶剂微流量泵,156示差折光检测器,System Gold 控制及数据处理系统(带有分子量计算辅助软件).分离柱:4000SW Spherogel TSK(i.d.13μm,直径7.5mm×300mm).带微孔过滤器(带0.3μm微孔滤膜).实验室常用玻璃器皿. 三,试剂 右旋糖酐. 无水硫酸钠. 醋酸钠. 碳酸氢钠. 氯化钠. 双蒸溜水. 四,测定步骤
分子量标准曲线制备