精确称取不同分子量的右旋糖酐标准品0.100g,用流动相溶解并定容至10mL.分别进样20μL,由分离得到各色谱峰的保留时间,将其数字输入分子量软件中,经校准后建立分子量对数值(logmW)与保留时间(RT)的标准曲线.结果表明,分子量在200×106至3.9×104范围内具有良好线性.
2. 色谱条件.流动相:0.2mol/L硫酸钠溶液,流速:0 .8mL/min.检测条件:示差检测器(以流动相作参比液,灵敏度16AUFS). 3. 标准工作曲线.
精确称取相对分子质量50000的右旋糖酐0.100g,定容在5mL定量瓶中,再进一步稀释为10,5,2,1mg/ mL标准液.分别进样,根据浓度与峰面积关系绘制曲线. 样品预处理和测定.
称取一定量样品(多糖含量应大于1mg),用流动相溶解并定容至100mL,混匀后经0.3μm的微孔滤膜过滤后即可进样.若样液不易过滤,可将其移入离心管中,在5000r/min下离心20min,吸取5mL左右的上清液,再经0.3μm的抽孔滤膜过滤,收集少量滤液按色谱条件进样测定. 五,结果计算
1.分子量分布计算
等测样品经分离后得到不同分子量峰的保留时间值,通过分子量标准工作曲线即可计算出多糖分了量分布.该计算程序由分子量辅助软件自动进行. 2.多糖含量计算
选择与待测样品多糖分子量相近标准右旋糖酐为基准物质,用峰面积外标法定量,计算公式如下: ρ×V
含量[mg/100g(或mL)]= ×100 m
(以右旋糖酐计) 式中:
ρ:进样样液多糖浓度(mg/mL); m:样品质量(g或mL); V:提取液的体积mL.
第十八节 磷脂含量的测定方法(分光光度法) 一,方法提要
样品中磷脂,经消化后定量成磷,加钼酸铵反应生成钼蓝,其颜色深浅与磷含量(即磷脂含量)在一定范围内成正比,借此可定量磷脂. 二,仪器 分光光度计. 消化装置等. 三,试剂 72%高氯酸. 5%钼酸铵溶液.
3. 1% 2,4-二氯酚溶液:取0.5g2,4-二氯酚盐酸盐溶于20%亚硫酸氢钠溶液50mL中,过滤,滤液备用,临用现配.
4. 磷酸盐标准溶液:取干燥的磷酸二氢钾(KH2PO4)溶于蒸馏水并稀释至100mL,用水100倍稀释,配制成含磷10μg/mL溶液. 四,测定步骤
1.脂质的提取
将供检样品粉碎,脱脂,再过柱(将活化的硅胶,按每分离1g样品用8g的比例,用正已烷混匀装柱),以苯:乙醚(9:1),乙醚各300mL依次洗脱溶出中性物质.用200mL三氯甲烷,100mL含5%丙酮的三氯甲烷洗脱,溶出糖质.再用100mL含10%甲醇的丙酮,400mL甲醇洗脱,得磷脂,供分析用. 2.消化
取含磷约0.5~10μg的磷脂置于硬质玻璃消化管中,挥去溶剂,加0.4mL高氯酸加热至消化完全,若不够再补加0.4mL高氯酸继续消化至完全. 3.测定
向消化好试管中加4.2mL蒸馏水,0.2mL钼酸铵溶液,0.2mL二氯酚溶液.试管口上盖一小烧杯,放在沸水浴中加热7min,冷却15min后,移入1cm比色皿中,于波长630nm处测定吸光度.同时用磷标准0～14μg制作工作曲线,求磷含量. 五,结果计算
供试磷脂的总磷量(mg) 总磷(%)= ×100 供试磷脂的质量(mg)
磷脂含量(%)=总磷(%)×25 说明:
脂肪中磷脂占24.6%,糖脂占9.6%,中性物质占65.8%. 第十九节 花生四烯酸含量的测定方法(GC) 一,方法提要
花生四烯酸(AA)为二十碳不饱和脂肪酸,在体内能转化成一系列生物活性物质,具有重要的生理功能.AA含量测定可利用有机溶剂将组织中的花生四烯酸分离提取出来,经甲酯化,采用气相谱法测定. 二,仪器
HP5840A型气相色谱仪.分离柱为长2m内径4mm螺旋形玻璃管,载体:Chromosorb W AW,DMCS,80～100目;固定液:10TGS(二乙二醇丁酸酯),柱温:190℃,检测器:FID,温度300℃,气化温度280℃,载气:高纯氮;流速60mL/min,燃气;高纯氢,30mL/min,助燃气:压缩空气,250mL/min,记录速度5mm/min. 三,试剂
花生四烯酸甲酯. 氯仿. 甲醇.
KOH(A.R.).
0.5mol/L KOH-甲醇溶液. 四,测定步骤
样品AA提取及甲酯化
血中红细胞膜样品制备:以血离心去血浆层得红细胞,用等渗溶液洗三次,再用10mmol/L Tris缓冲液溶血,离心去血红蛋白.红细胞膜以相同的缓冲液洗三次,得到乳白色红细胞膜.取适量待测样品,放入到带塞玻璃试管中,加2.5 mL氯仿-甲醇混合液(2:1体积分数),振摇1min,以3500r/min离心12min,小心吸出全部液体,将其转移到另一试管中,氮气吹干,再用1mL磷脂溶液溶解,将溶解液转移至10mL容量瓶中,加入1mL 0.5mol/L KOH-甲醇溶液,振荡1min,室温放置15min,加蒸馏水至刻度,摇匀,静置分层,取1μL进行气相色谱分析.
标准样品
标准花生四烯酸甲酯1mg/mL,进样1μL. 五,结果计算
将待测样品与标准样保留时间比较定性,采用外标定量. 第二十节 β-胡萝卜素含量的测定方法(HPLC法) 一,方法提要
β-胡萝卜素为脂溶性维生素A的前体,存在各种动植物体中,所以可直接用有机溶剂提取后进行检测.利用反相色谱法分析. 二,仪器
高效液相色谱仪,紫外检测器,记录仪或积分仪,分析天平等. 三,试剂 已烷. 甲醇.
无水硫酸钠. 乙酸乙酯.
BHT(叔丁基羟基甲苯). 氮气.
氢氧化钾.
8. β-胡萝卜素标准液:准确称取标样5.000mg,乙酸乙酯溶解并定容50mL.冰箱中保存,上机前再稀释50倍. 四,测定步骤 1.样品处理
取样品的可食部分洗净切碎,置组织捣碎机捣碎成浆状,称5～10g样品,放入研钵中,同时加少量甲醇,已烷研磨,然后倒入布氏漏斗抽滤,并不断用甲醇,已烷冲洗研钵及残渣,直至残渣为白色.将含有样品的溶液倒入事先装有50mL已烷的分液漏斗中,用蒸馏水冲洗抽滤瓶2～3次,洗液并入分液漏斗中,振摇分液漏斗后静止分层,将下层溶液放入装有30mL正已烷的另一分液漏斗中,向第一分液漏斗中加10mL20% 氢氧化钾的甲醇溶液,振摇后分层,上层为黄色溶液.将下层放入另一分液漏斗中,处理同上.合并二次正已烷提取液,用蒸馏水洗至中性,然后用无水硫酸钠脱水,提取液转移到100mL棕色容量瓶中,加0.1gBHT,并用已烷冲洗分液漏斗数次,最后定容至刻度.上机前取1～2mL提取液于小试管中,氮气吹干,用1.0mL乙酸乙酯溶解后上机. 2.色谱条件
色谱柱:μ-Bondapak C-18直径300mm×3.9mm); 流动相:100%甲醇; 流速:1.2mL/min;
检测器:可见光440nm; 衰减:0.08AT; 纸速:0.4cm/min; 柱温:室温;
进样量:20μL . 五,结果计算
根据标准样品的保留时间定性,标准的峰高或峰面积与样品峰的比较而定量. 六,注释
β-胡萝卜素遇光和氧都会迅速破坏,所以样品应避光保存,所用标准β-胡萝卜素必须临时配制.
第二十一节 维生素E和胡萝卡素含量的测定方法 一,方法提要
采用石油醚直接冷磨匀浆法提取,不需皂化等操作手续,样品提取液通过氧化铝柱后,维生素E,胡萝卜素被定量吸附,用乙酸乙酯-石油醚混合溶剂分次洗脱出维生素E,胡萝卜素,提高了分离效果,可进行两种维生素含量测定.适合脂肪含量低的食品分析. 二,仪器
岛津RF-510荧光分光光度计.
721型分光光度计(或其他光电比色计). 三,试剂 乙酸乙酯.
石油醚(60~90℃). 氧化铝. 无水硫酸钠. 石英砂.
标准品:dl-α生育酚以石油醚(60～90℃)稀释至5μg/mL.
7. 氧化铝层析柱:使用前先做维生素E,胡萝卜素吸附洗脱回收实验,必要时需活化处理.取25～27cm层析柱(层析部分:内径0.8cm,长9cm)在细颈端填塞脱脂棉,装入氧化铝3～4g至低于细颈上端0.5cm处,用手轻轻拍柱使氧化铝均匀,上加0.5g无水硫酸钠,在层析分离时先用部分石油醚过柱,再加样品液. 四,测定步骤 1.样品液制备
称取5～10g植物样品(或其他食品),加一定量无水硫酸钠和石英沙,再加石油醚,在玻璃乳钵内磨匀成浆,静置,用玻璃吸管取上清液,移入50mL容量瓶中,重量提取4～5次至刻度. 2.上柱.
取5mL石油醚提取液加到氧化铝柱内,开启水泵让石油醚提取液过柱,弃去石油醚流下液.改用含3%乙酸乙酯的石油醚洗脱,弃去部分洗脱液(约3mL),收集洗脱液至15mL,即为样品胡萝卜素测定液.再用含90%乙酸乙酯的石油醚洗脱,弃去部分洗脱液(约3mL),收集洗脱液至15mL,即为样品维生素E测定液.取2.5mL胡萝卜标准液(5μg/mL)和2.5 mL维生素E标准液(5μg/mL)混合液,按上操作,收集即为标准测定液.另取5mL石油醚代替5mL标准混合液,同上处理,即为试剂空白液.
3,测定.
在岛津RF-510荧光分光光度计上,激发波长295nm,荧光波长325nm,狭缝10nm,灵敏度开关置于50(狭缝和灵敏度开关根据需要调节),用1cm比色皿(以试剂空白调荧光强度为零),读样品测定液和标准测定液荧光强度,测定维生素E.在721型或其他分光光度计上,波长为448nm,2cm比色皿(以试剂空白调光密度为零),读样品测定液和标准液光密度,测定胡萝卜素. 五,结果计算 5×A 50×100
样品维生素E含量(mg/100g)= ×
B m×1000 5×C 50×100
样品胡萝卜维含量(mg/100g)= × D m×1000 式中:
A:样品液荧光强度;
B:维生素E标准液荧光强度; C:样品液光密度值;
D:胡萝卜素标准液光密度值; m:样品质量(g).
第二十二节 微量硒含量的测定方法(分光光度法) 一,方法提要
硼氢化钾在酸性溶液中(1.5～4.0mol/L盐酸浓度)使硒(IV)还原成H2Se挥发分离出来,用邻菲罗啉铁(III)溶液吸收.H2Se再还原邻菲罗啉铁生成橙红色邻菲罗啉亚铁,其颜色深度与硒的浓度在一定范围内符合比尔定律.用氢化物分离一邻菲罗啉铁分光光度法测定微量硒含量的方法,操作较简便,干扰离子少,相对误差在1%以下,最低检出限为0.2μg.
二,仪器
分析天平(感量0.0001g).
721型分光光度计(或其他分光光度计). 氢化物发生及吸收装置. 凯氏消化瓶(50mL). 砂浴或控温电炉. 三,试剂
1.硒标准溶液:将光谱纯硒溶于少量硝酸中,加水配成1.00mg/mL硒贮备液,使用时用0.05mol/L H2SO4稀释成1.00μg /mL硒的标准液.
2.硼氢化钾溶液(3%):将硼氢化钾3g溶于100mL0.5%KOH的水溶液,滤去不溶物,贮于聚乙烯瓶中.
3.硒化氢吸收液:在50mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4)中,加入75mL0.2%邻菲罗啉水溶液及5mL含Fe+++2 mg/mL的硫酸铵水溶液,加蒸馏水至500mL.
4.pH4的醋酸-醋酸钠缓冲液0.2mol/L NaAC18mL与0.2mol/L HAC 82mL混合即成.
200g/L亚铁氰化钾溶液. 5mol/L HCl溶液. 四,测定步骤
1.标准曲线制备.
取0～10μg硒(IV)标准液,依次加到氢化物发生及吸收装置的反应瓶中,均加5mol/L盐酸15mL,以蒸馏水补充至30mL.在U型玻璃吸收管中装入7.0mL吸收液,在筒形加液漏斗中加入KBH4溶液20mL,盖好塞子,通氮气(或用给气球打气)加压,缓缓开启活塞,让KBH4溶液在3.5~4min内全部加到反应瓶中,控制加入速度以保持吸收液气泡升至吸收管半球部为宜.加完后,鼓气约1min,有助于将可能残存的H2Se自反应液中带出.吸收完后,于25℃室温下放置15min,颜色可达稳定,在508nm下测定吸收液的光密度.以光密度为纵坐标,相应硒含量为横坐标制备工