(0.063,0.125,0.250,0.500,1.000mg/mL)依次进样10μL,测定各浓度相应的峰面积值,绘制标准曲线.
回归方程:y=1.5351×10-6 x-2.7416×10-2 ,r=0.9991. 线性范围:0.063~1.000mg/mL 4.样品测定
取样品处理液10μL注入高效液相色谱仪分离测定,以标准品峰的保留时间定性,并根据样品组分的峰面积在标准曲线上查出相应组分含量. 五,结果计算 X=
式中X——褪黑素的含量(mg/100g);
m1——从标准曲线上查得相应的黑素的质量(μg); V1——样品定容总体积(μL) V2——进样量(μL) M——样品质量(g)
第五节 肉碱(L——Carnitine)的测定方法(高效液相色谱法) 本方法适用于添加左旋肉碱的功能性食品中肉碱的测定. 本方法肉碱最小检出量为1.82μg. 一,方法提要
样品的水溶液用高效液相色谱法将左旋肉碱分离,经紫外检测器检测,测定出相应的峰面积,用外标或内标法定量. 二,仪器
1.Bio—Rad700高效液相色谱仪,UV-1706紫外检测器. 2.超声波振荡器.
3.微孔过滤器(滤膜0.45μm). 三,试剂
1.甲醇:色谱纯(浙江黄岩化工实验厂). 2.水:为三蒸水并经Milli—Q超纯处理.
3.离子对色谱试剂:IPR—B7(庚烷磺酸钠·C7H15SO3Na):天津市化学试剂二厂. 4.磷酸(H3PO4):分析纯. 5.氢氧化钠(NaOH):分析纯.
6.左旋肉碱标准品:L—4—氨基—羟基丁酸(C7H15NO3),由瑞士龙沙公司提供. 7.对氨基苯甲酸:C7H7NO2,分析纯:准确称取100mg对氨基苯甲酸用水溶解于100mL容量瓶中,加水至刻度,配成1mg/mL的内标溶液(样品用);此液用水稀释10倍为0.1mg/mL(标准用).
8.标准溶液:准确称取25,50,75,100,125mg的左旋肉碱标准品溶于流动相中,用流动相稀释至25mL刻度,配成每1ml的内标溶液(样品用);此液用水稀释至25mL刻度,配成每1mL含1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mg左旋肉碱.
内标法:同上,但内含0.1mg/mL对氨基苯甲酸5mL(最终浓度=0.02mg/mL). 四,测定步骤 1.样品处理 (1)外标法
准确称取含左旋肉碱500mg左右的样品于50mL容量瓶中,加水约40mL,置超声振荡器中20min助溶,冷却,用水稀释至放刻度,过滤,吸取5mL.滤液于25mL溶量瓶中,用流动相稀释至刻度,经0.45μm滤膜过滤,滤液备用.
(2)内标法
准确称取含左旋肉碱500mg左右的样品于50mL容量瓶中,加水约40mL,及5mL (1.0mg/mL)对氨基苯甲酸,置超声振荡器中同上处理. 2.色谱分离条件
色谱柱:BIO-RAD BIO—SIL OBS.10 250mm×4mm.
流动相:吸取2.5mL磷酸于475mL水中,加入25mLlmol/L NaOH摇匀,调整pH2.4,再加入50mg庚烷磺酸钠(B7),溶解后加入260mL甲醇. 紫外检测器检测波长:2l0nm. 流 速:1mL/min 灵敏度:0.00l. 进样量:20μL
3.标准曲线的绘制
分别准确吸取以上各种浓度的标准溶液和样品滤液20μL于HPLC中进行测定,记录各组分峰面积,以左旋肉碱的浓度为横坐标,左旋肉碱的峰面积(或与内标峰的面积比值)为纵坐标绘制标准曲线.
左旋肉碱浓度在1.0~5.0mg/mL,线性良好,线性回归方程y=-0.0086+0.1061x,相关系数r=0.9997. 4.样品测定
准确吸取样品滤液20μL于HPLC中,并根据样品组分的峰面积(或与内标峰的面积比值)在标准曲线上查出相应的左旋肉碱的含量. 五,结果计算 X=
式中 X——左旋肉碱的百分含量(%);
m1——在标准曲线上查出相应的左旋肉碱质量(mg); n——样品的稀释倍数; m——样品质量(g); 1000——mg换算成g. 六,注释
1.关于标准品
左旋肉碱(L—Carnitine)极易吸水变潮,故称量时要注意标准品是否干燥,如潮解不能烘干再用,亦可选用左旋肉碱酒石酸盐(L—Carnitine tartrate)或消旋肉碱盐酸盐(DL—Carnitine hydrochloride)等作标准品,但要注意换算:如从L—Carnitine tartrate换算为L—Carnitine要乘系数0.682,从L—Carnitine换算为L—Carnitine tartrate要乘系数1.4655.用左旋肉碱酒石酸盐作标准品时,色谱图中在前面多出一个酒石酸盐的色谱峰.
2.本法引自美国药典U.S.P—NF 1995(I),流动相只适用于含杂质较少的样品,如保健食品中配方复杂并添加了中草药,维生素及其他赋形剂等,可将流动相用水或pH2.4的磷酸盐缓冲液稀释3~4倍并适当添加离子对试剂的用量;如样品为口服液或饮料,流动相中水相(pH2.4的磷酸盐缓冲液)与甲醇的比例可延至98:2,庚烷磺酸钠可加至555mg.
3.左旋肉碱才具有生理活性.本法最大的缺点是不能将右旋和消旋的肉碱区分开. 第六节 免疫球蛋白IgG的测定方法(单向免疫扩散法)
本方法适用于功能性食品中免疫球蛋白IgG的测定,其中IgG的最低检出限为
20μg/mL. 一,方法提要
在含有抗体的琼脂板的小孔中加入抗原溶液,经过扩散后,在小孔周围形成抗原体沉淀环,此沉淀环面积与小孔中的抗原量成正比.测定样品中IgG时,琼脂板中可加入适量的免抗牛IgG抗血清,琼脂板各小孔中分别是加入一系列的己知IgG含量的对照标准品及适量稀释的待测IgG乳粉样品,经过24h扩散后,测量各沉淀环直径.以IgG标准品系列浓度为横坐标,沉淀环直径的平方为纵坐标绘制标准曲线,根据待测IgG样品形成的沉淀环直径查标准曲线得到对应的IgG浓度即可计算其含量.
二,仪器 1.琼脂模板
由二块7.5cm×18cm玻璃板中间隔放一块有机玻璃U形板(厚0.22cm,各边宽lcm,底边长18cm,底边长18cm,两边长7.5cm)构成,用弹簧夹紧. 2.打孔器,Ф 2.5mm.
3.湿盒:有盖搪瓷盘,盘底铺垫纱布3~4层,用0.5%苯酚溶液浸湿纱布. 4.微量进样器. 5.水浴锅. 三,试剂
1.pH6.8磷酸盐缓冲液:称取分析纯的磷酸氢二钾6.8g和氢氧化钠0.94g,加蒸馏水溶解并稀释至1L,混匀. 2.优质琼脂.
3.兔抗牛lgG抗血清(生化试剂):效价为1:32. 4.牛IgG对照标准品(生化试剂): Sigma公司提供. 四,测定步骤
1.抗体琼脂板的制备
在pH6.8磷酸盐缓冲液中加入1.0%琼脂,加热溶化,冷却到55℃,并在55℃水浴中保温,然后加入抗牛IgG抗血清(效价为1:32,添加量为体积的1/80),迅速混合后倒入琼脂模板内.待琼脂凝固后(需10~15min),将上面的玻璃板小心取去,再取去U形板,用打孔器相隔1.5cm打孔一个,并挑出孔内琼脂块. 2.标准曲线绘制
取牛IgG对照标准品,以pH6.8磷酸盐缓冲液溶解,分别稀释配成浓度为
0.05,0.10,0.20,0.40,0.80,1.00mg/mL的系列标准溶液.然后,将上述对照标准溶液分别加入抗体琼脂板的小孔中,每小孔5μL(双样).加样后将琼脂板放入湿盒中,在37℃ 放置24h,取出,准确测量沉淀环直径以牛IgG浓度为横坐标,沉淀环直径平方为纵坐标绘制标准曲线. 3.样品中IgG含量的测定
根据样品中lgG含量高低称取适量样品,用pH6.8磷酸盐缓冲液溶解并适当稀释,然后按标准曲线操作步骤在抗体琼脂板小孔中加样,扩散,测量沉淀环直径,根据标准曲线查得样品中相应1gG浓度,并计算样品IgG含量.
说明:观察结果时,可于暗室内,以台灯斜照琼脂板,背后用黑纸作背景,琼脂板玻璃面朝向观察者,将透明厘米尺紧贴玻璃板,测量沉淀环的直径. 五,注释
1.免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)对增强机体的免疫抗病能力已早为人知.近
年来,随着IgG应用于功能性食品的研究,发现IgG在调节动物体的生理功能,如改善胃肠道功能(调节肠道菌群),促进生长发育等方面起重要作用.有关测定IgG的方法,目前国内外有:电泳法,免疫荧光技术,放射免疫法,高效液相色谱法等.本文介绍的单向免疫扩散法是一种经典方法,设备简单,方法易于推广. 2.本方法在IgG浓度为0.05~1.0mg/mL范围内呈线性关系,对于含有初乳素的奶粉,奶片,胶囊,羊胎素均可测定.
第七节 EPA和DHA的测定方法(气相色谱法)
本方法适用于以鱼油为主要成分的功能性食品中EPA和DHA检测,其中EPA的最低检出量为20μg/mL,DHA的最低检出量为60μg/mL. 一,方法提要
样品经三氟化硼甲醇甲酯化后,用正己烷提取,经DEGS气相色谱柱分离,并附氢火焰离子化检测器测定,用相对保留时间定性,与标准系列的峰高比较定量. 二,仪器
1.气相色谱仪:附氢火焰离子化检测器. 2.超级恒温水浴:精度(±0.1℃ ). 3.Eppendorf管(EP管):0.5～1.0mL. 三,试剂
所用试剂除注明者外,均为分析纯;水为重蒸馏水.
1. 0.5mol/L氢氧化钠甲醇溶液:称取2.0g氢氧化钠溶于少量无水甲醇中,并稀释定容至l00mL.
2. 饱和氯化钠溶液:称取72g氯化钠溶解于200mL蒸馏水中.
3. 三氯化硼甲醇溶液:量取浓度约为47%三氯化硼乙醚溶液30mL,加入到75mL无水甲醇中,混匀. 4. 正己烷.
5. 甲醇:优级纯.
6. EPA和DHA的甲酯标准储备液:采用Sigma公司标准品(cis—5,8,11,14,17—Pentaenoic Acid Methyl
Ester,Approx.99%,cis—4,7,10,13,16,19 Docosahxaenoic Acid Methyl Ester,Approx.98%).准确称取0.050gEPA 和0.100gDHA 用正己烷溶解,并定容于10mL容量瓶,此标准储备液EPA浓度为5.0mg/mL,DHA浓度为10.0mg/mL. (7)FPA和DHA的甲酯标准使用液:将标准储备液用正己烷稀释成EPA浓度为1.00,2.00,3.00,4.00,5.00mg/mL, DHA浓度为2.00,4.00,6.00,8.00,10.00mg/mL.
四,测定步骤 1.样品处理
准确吸取10~20μL鱼油于10mL具塞比色管中,加入0.5mol/L氢氧化钠甲醇溶液2mL,充氮气,加塞,于60℃水浴中(约10min)至小油滴完全消失.加入三氯化硼甲醇溶液2mL和正己烷0.5mL,充分振荡萃取,静置分层.取上层正己烷液于EP管中,加少量无水硫酸钠,充氮气,于4 ℃冰箱中保存,备色谱分析. 2.色谱参考条件
色谱柱:玻璃柱或不锈钢柱,内径3mm,长2m.内充填涂以8%(质量分
数)DEGS+1%(质量分数)H3PO4固定液的60~80目Chromosorb W. AW. DMCS. 气体流速:载气N2 50mL/min(氮气和空气和氢气之比按各仪器型号不同选择最佳
比例).
温度:进样口210 ℃,检测器21 0℃,柱温190℃. 进样量:1μL.
3.标准曲线的绘制
用微量进样器准确取lμL标准系列各浓度标准使用液注入气相色谱仪,以测得的不同浓度的EPA和DHA的峰高为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线. 4.样品测定
准确吸取1μL样品溶液进样,测得的峰高与标准曲线比较定量. 五,结果计算 X= V2 V1
式中 X——样品中EPA,DHA的含量(mg/100g); ml——测定用样品液中的质量(μg); m——样品的质量(g);
Vl——加入正己烷的体积(μL) V2——测定时进样的体积(μL)
EPA和DHA回收率分别为(96.2±3)%和(95.8±4)%,精密度相对标准差分别为1.86%和2.11%.
六,注释
1.二十碳五烯酸(allc is—5,8,11,14,17 eicosapenoic acid EPA)和二十二碳六烯酸(allc is—4,7,10,13,16,19 Docosahex—aenoic acid DHA)为超长链不饱和脂肪酸,具有预防血管疾病,降低血脂,抗癌,抗过敏等作用,因此鱼油制品被广泛应用于医药及保健食品中.
2.鱼油制品用三氟化硼—甲醇溶液酯化.并采用充填8TGS+1%H3PO4固定液的色谱柱分离,克服了样品中其他物质的干扰,显示出良好的准确度和精密度. 3.本法同时可以适用于测定油酸,亚油酸和亚麻酸.色谱条件:柱温160 ℃,进样口及检测器190℃,其他条件(包括样品处理)与本法相同.
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,简称SOD)的测定方法
本方法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品(如生鱼片,动物血等初加工肉制品),乳制品,各类水果蔬菜,果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定. 超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶, O+O+2H+ → H2O2+O2
测酶活方法很多,本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚氧化法.
一,氮蓝四唑法 1.方法提要
在电子供体如甲硫氨酸存在下,核黄素受光激发,与电子供体反应被还原.在氧气中,还原的核黄素与氧反应产生O,O 将无色(或微黄)的氮蓝四唑还原为蓝
色,SOD通过催化O歧化反应,生成O2与H2O2,从而抑制蓝色形成.按抑制蓝色物形成的50%为一酶活单位.酶活力越高,抑制50%蓝色形成所需酶量越少. 2.仪器 荧光灯管.