试验药品：供试药品用制剂或纯品。摄入毒性试验用药以蒸馏水配制成母液供试验用，易溶于水的物质直接用蒸馏水配制，难溶于水或不溶于水的可用少量毒性小的有机溶剂助溶，并在试验时设置溶剂对照组。触杀毒性试验用药以丙酮配制成一定浓度的溶液供试验用。
主要仪器设备：试验蜂笼、生化培养箱、微量注射器、烧杯等玻璃器皿。 试验条件：试验在温度25-30?C，相对湿度70-80%，微光条件下进行。 （2）试验方法
摄入毒性：将贮蜂笼内的蜜蜂引入试验笼中，每笼20只。不同浓度药液与蜂蜜以2:1混匀，制成药蜜，装入10 mL小烧杯中，杯内浸渍0.3g脱脂棉，杯口向下倒置于试验笼纱网上，通过网眼供蜜蜂摄食。正式试验前先做预试，可以较大的间距设置4~5个浓度组，求出受试蜜蜂最高全存活浓度与最低全致死浓度。正式试验时在此浓度范围内按一定间距设置5~7个浓度组，每组20只蜜蜂，并设空白对照组，使用有机溶剂助溶的还需设置溶剂对照组。对照组及每一处理组均设3个平行。记录处理24h、48h死亡数，对试验数据进行数理统计，求出LC50值及95%置信限。
触杀毒性：供试农药用丙酮溶解，配制成不同浓度的药液。将蜜蜂移入塑料网袋中，轻轻拉紧固定于点滴框上，蜜蜂被夹在两层纱网中。通过网孔对准蜜蜂前胸背板处，用微量注射器分别点滴规定浓度供试药液1.0~1.5μL，待蜂身晾干后转入试验笼中，用脱脂棉浸泡适量蜜和水饲喂。正式试验前先做预试，可以较大的间距设置4~5个浓度组，求出受试蜜蜂的最高全存活浓度和最低全致死浓度。正式试验时在此浓度范围内按一定间距设置5~7个浓度组，每笼20只蜜蜂。同时设立空白对照组及溶剂对照组，对照组及每一浓度组均设3个平行。观察24和48 h受试蜜蜂有无中毒症状及死亡现象，记录死亡数，对试验数据进行数理统计，计算LD50值及95%置信限。 （3） 数据处理
蜜蜂摄入毒性的半数致死浓度LC50和触杀毒性的半数致死剂量LD50的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算（具体计算方法参见2.2.1数据处理），也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。 （4）质量控制
① 投喂药品及饲养期间，农药含量不能低于规定含量的80%。
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② 试验结束时，对照组死亡率不超过10%。 （5）评价标准
根据毒性测定结果将农药对蜜蜂的毒性分为四个等级（见表9）。
表9 农药对蜜蜂的毒性等级划分
毒性等级 剧毒 高毒 中毒 低毒
触杀法（μg/蜂） LD50≤0.001 0.001＜LD50≤2.0 2.0＜LD50≤11.0 LD50＞11.0
摄入法（mg/L） LC50≤0.5 0.5＜LC50≤20 20＜LC50≤200 LC50＞200
（6） 试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度。
② 试验生物的名称、来源、大小及饲养情况。 ③ 试验条件：试验温度、试验方法等。
④ 试验液的浓度，24、48h-LC50或24、48h-LD50值和95%置信限，并给出所采用的计算方法。
⑤ 对照组蜜蜂是否出现死亡及异常反应。
⑥ 观察到的效应，如受试蜜蜂的任何不正常的行为、中毒症状等。 ⑦ 试验结果及毒性评价。
2.2.3家蚕毒性试验
通过测定农药对家蚕的LC50，评价农药对家蚕的急性毒性，提供农药对生态环境影响的资料。家蚕品种较多，选择有代表性的家蚕品种作试验材料。
（1）试验材料
试验生物：选择有代表性的家蚕品种，以二龄蚕为毒性试验材料。 试验药品：供试药品用制剂或纯品。易溶于水的用蒸馏水配制成一定浓度供试验用，难溶于水的可用少量毒性小的有机溶剂助溶，并在试验时设置溶剂对照组。
主要仪器设备：恒温培养箱、直径9 cm玻璃培养皿及烧杯等玻璃器皿。 试验条件：蚁蚕饲养温度为25±1?C，相对湿度为80~85%。
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（2）试验方法
食下毒叶法：在直径9 cm的玻璃皿内饲养二龄起蚕，用不同浓度的药液定量浸渍桑叶，以5 mL药液浸渍5g桑叶，凉干供蚕食用。正式试验前先做预试，可以较大的间距设置4~5个浓度组，求出受试家蚕最高全存活浓度和最低全致死浓度。正式试验时，在此浓度范围内按一定间距设置5~7个浓度组，每组20头蚕，并设空白对照，加溶剂助溶的还需设溶剂对照。对照组和每一浓度组均设3个平行。整个试验期间饲喂处理桑叶，观察24 h、48 h、96 h、至三龄起，受试家蚕的中毒症状及死亡情况。试验结束后对数据进行数理统计，计算半致死浓度LC50值及95%置信限。
熏蒸法：在熏蒸箱内进行试验，熏蒸箱由燃烧室和熏蒸室两部分组成。试验蚕置于熏蒸室内，供试蚊香定量地在燃烧室内燃烧（或电热片加热），燃烧烟气通过循环泵送入熏蒸室内。从熏蒸开始，按0.5、2、4、6、8 h观察记录熏蒸试验装置内家蚕的毒性反应症状，8h后，将熏蒸试验装置内放置的培养皿取出，放置于家蚕常规饲养室作进一步观察，继续观察 24h及48h的家蚕死亡率。每个试验箱内设置九个重复，同时设置空白对照，设三个重复。
试验观察要求：观察记录项目主要包括摄食情况（减少或拒食）、不适症状（逃避、昂头、晃头、甩头、扭曲挣扎、吐水等）及死亡率。 （3）数据处理
家蚕的半致死浓度LC50的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算（具体计算方法参见2.2.1数据处理），也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。
（4）质量控制
① 空白对照组死亡率不超过10%。
② 试验期间，应保持试验室条件正常，如出现各种原因的故障，须重做试验。
（5）评价标准
农药对家蚕的毒性等级划分标准分为四级，并可根据田间施药浓度/ LC50值，进行风险性分析（见表10）:
表10 农药对家蚕的毒性与风险性等级划分
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毒性等级 剧毒 高毒 中毒 低毒
LC50（mg/kg桑叶）
LC50≤0.5 0.5＜LC50≤20 20＜LC50≤200 LC50＞200
风险性等级 极高风险性 高风险性 中等风险性 低风险性
田间施药浓度/ LC50
＞10 1.0~10 0.1~1.0 ＜0.1
熏蒸试验是针对卫生用药模拟室内灭蚊条件下进行的试验，如果家蚕的死亡率大于10%以上时，即可视对家蚕有危害风险性，应在蚕室内及附近禁止使用。 （6）试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度。
② 试验生物的名称、来源、大小及饲养情况。 ③ 试验条件：试验温度、试验方法等。
④ 试验液的浓度、24h、48h、96 h的LC50值和95%置信限，并给出所采用的计算方法。
⑤ 对照组家蚕是否出现死亡及异常反应。
⑥ 观察到的效应，如受试家蚕的任何不正常的行为、中毒症状等。 ⑦ 试验结果及毒性评价。
2.2.4鱼类毒性试验
通过测定农药对鱼类的LC50，评价农药对鱼类的急性毒性，提供农药对生态环境影响的资料。鱼类的急性毒性测定方法有静态法、半静态法与流动法三种。最常用的是半静态法，即在试验期间每隔12h或24h更换一次药液，以保持试验药液的浓度不低于初始浓度的80％。
（1）试验材料
试验生物：试验鱼种可选用斑马鱼（Brachydonio rerio）（体长3?0.5 cm，体重0.3?0.1 g）、鲤鱼（Cyprinus carpio）的幼鱼（体长3~4 cm）等作材料。 试验用鱼健壮无病，大小一致。试验前在与试验时相同的环境条件下驯养7~14 d，驯养期间每天喂食1~2次，曝气充氧，每日光照12~16 h，及时清除粪便及食物残渣。试验前24 h停止喂食。
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稀释水：试验用稀释水为经活性碳处理并曝气处理24h以上的自来水。水质硬度在150~300mg/L之间（以CaCO3计），pH值在6~8.5之间，溶解氧保持在5.8mg/L以上。
试验溶液的制备：易溶于水的农药用蒸馏水配制成母液；难溶于水的用超声波粉碎法制备，也可加入低毒的有机溶剂或乳化剂（如丙酮或吐温-80）助溶，用量小于0.1 mL/L，并在试验时设置溶剂对照组。母液每日配制一次，比较稳定的物质二日配制一次，配好后低温存放。试验时用母液稀释配制成不同浓度的试验溶液。
试验条件：室温保持在20~25?C，光照采用自然光照。 参比物质：重铬酸钾（K2Cr2O7），分析纯。
主要仪器设备：溶解氧测定仪、温度计、15L玻璃缸、量筒等玻璃器皿及尼龙纱网等。
（2）试验方法 ① 预试验
预试验按正式试验的条件，以较大的间距设若干组浓度。每处理组放入10尾鱼，观察并记录受试鱼96h的死亡情况和中毒症状。通过预试求出受试鱼最高全存活浓度及最低全致死浓度，为正式试验确定浓度范围。
② 正式试验
在预试验确定的浓度范围内以一定级差间距设置5~7个浓度组，并设一个
稀释水对照组，使用有机溶剂助溶的增设溶剂对照组，每个浓度组重复三次。每缸放入鱼10尾，试验开始后6h内随时观察并记录受试鱼的中毒症状及死亡率，其后于24 h、48 h、72h、96h观察并记录受试鱼的中毒症状及死亡率，及时清除死鱼。每天测定并记录试液温度、pH及溶解氧。
为检验本实验室的设备、条件、方法及试验鱼的质量是否合乎要求，设置“参
比毒物”作方法学上的可靠性检验。在相同的试验条件下，以重铬酸钾为参比毒物，斑马鱼作试验材料，其24h-LC50必须处于200~400 mg/L之间。对照组鱼的死亡率不得超过10%，否则试验无效，须换一批鱼重做。
（3）数据处理
鱼类96h-LC50的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算（具体计算方法参见2.2.1数据处理），也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计
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