算。
（4）质量控制
① 驯养期间死亡率不得超过5%；空白对照组死亡率不超过10%。 ② 以重铬酸钾为参比物质，斑马鱼为试验材料，24h-LC50必须处于200~400 mg/L之间。
③ 试验期间，试验溶液的溶解氧含量不低于5.8 mg/L。 （5）评价标准
农药对鱼类毒性等级划分标准分为四级（见表11）：
表11 农药对鱼类的毒性等级划分标准 毒性等级 剧毒 高毒 中毒 低毒
96h-LC50 (mg/L) LC50≤0.1 0.1＜LC50≤1.0 1.0＜LC50≤10 LC50＞10
（6）试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度和理化性状。 ② 试验鱼名称、来源、大小及驯养情况。
③ 试验条件：水温、光照、溶解氧、pH值、水质等。
④ 试验液浓度及试验开始后24、48、72、96h的LC50值和95%置信限、中毒症状及所采用的计算方法。
⑤ 对照组鱼的死亡率、行为反应异常的比例。 ⑥ 试验结果及毒性评价。
2.2.5溞类毒性试验
溞类是重要的浮游动物，对毒物非常敏感，是评价化学物质环境生态毒性的重要的指示生物。测定农药对溞类的EC50或LC50，来评价农药对溞类的急性毒性。水溞活动受抑制的判断标准是缓慢摇动试验容器，15s内受试溞失去游动能力；水溞死亡的判断标准是其心脏停止跳动。
（1）试验材料
试验生物：大型溞（Daphnia magna straus）或其它的繁殖参数与大型溞可比的溞类。保持良好的培养条件，使大型溞的繁殖处于孤雌生殖状态。选用实验
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室条件下培养3代以上、出生6~24 h的幼溞，幼溞必须健康、活泼。
主要仪器设备：溶解氧测定仪、数字式酸度计、玻璃器皿等。
试验用稀释水：自来水经活性碳柱过滤，去除水中余氯及杂质，再用充气泵曝气至少24 h后使用。稀释水的理化参数为：pH 6.5~8.5，水质硬度在150~300 mg/L之间（以CaCO3计），Ca/Mg比例接近于4?1，溶解氧5.8mg/L以上，并不含有任何对大型溞有毒的物质。
试验溶液的制备：易溶于水的物质溶解于蒸馏水中配成贮备液，置冰箱内低温保存。试验时取规定量的贮备液加入到稀释水中配成所需浓度的试验溶液。难溶于水的物质可加入低毒的有机溶剂或乳化剂助溶，助溶剂在试验液中的浓度小于0.1mL/L，并在试验中设稀释水对照组和最大浓度的溶剂对照组。
参比物质：重铬酸钾（K2Cr2O7），分析纯。 （2）试验方法
试验条件：试验前的培养温度与试验温度（20±20C）基本一致，自然光照。培养大型溞的实验室及生化培养箱内不含有对大型溞有害的气体、粉尘等物质。
预试验：正式试验前，为确定试验浓度范围，需先进行预试验。预试验可采用较宽的浓度间距设置若干浓度组，每一浓度放5只幼溞，求出受试物质使大型溞100%活动受抑制的最低浓度和全不抑制的最大浓度，在此范围内设置正式试验的浓度。
正式试验：根据预试验的结果确定正式试验的浓度范围，按一定间距设置5~7个浓度组。试验用100 mL的烧杯装50 mL试验液，放入幼溞10只，每个浓度设3个平行。试验设1个稀释水空白对照组，使用溶剂助溶的还需设置溶剂对照组。试验开始后于24、48 h定时观察，记录每个容器中试受大型溞活动受抑制数。
大型溞敏感性和试验步骤合格性的检验：按上述试验步骤定期测定重铬酸钾对大型溞的24h-EC50。在20?C条件下，重铬酸钾对大型溞的24h-EC50为0.6~1.7 mg/L。如测定值在此范围之外，应检查试验步骤是否严格，并检查大型溞的培养方式，必要时重新获取试验用溞。
（3）数据处理
EC50的计算可采用寇氏法或概率单位图解法计算（具体计算方法参见2.2.1数据处理），也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。
（4）质量控制
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① 对照组试验不活动水溞数少于10%。
② 试验过程中受试物浓度不低于规定浓度的80%。
③ 定期进行参比物质试验，20?C条件下，重铬酸钾对大型溞24h-EC50必须处于0.6~1.7 mg/L之间。
④ 试验操作及试验过程中溞类不能离开水，转移时要用玻璃滴管。 （5）评价标准
农药对溞类毒性等级划分标准分为四级（见表12）：
表12 农药对溞类的毒性等级划分标准 毒性等级 剧毒 高毒 中毒 低毒
48h-EC50 (mg/L) EC50≤0.1 0.1＜EC50≤1.0 1.0＜EC50≤10 EC50＞10
（6）试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度。 ② 试验溞名称、来源、溞龄及培养条件。
③ 试验条件：水温、光照、溶解氧、pH值及水质等。
④ 试验液的浓度、试验开始后24、48h的EC50值及95%置信限及中毒症状，并给出所采用的计算方法。 ⑤ 试验结果与毒性评价。
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2.2.6藻类毒性试验
藻类生长抑制试验用于评价农药对藻类在种群水平上的影响。通过测定农药对藻类的EC50，评价农药对藻类的急性毒性，提供农药对生态环境影响的资料。农药对藻类的EC50用藻类生长抑制率表示。
（1）试验材料
受试藻种：试验可采用普通小球藻（ChLoreLLa vuLgaris）、斜生栅列藻（Scenedesmus obLiquus）、羊角月芽藻（Seoenastrum capricornutum）。
主要仪器设备：数字式酸度计、血球计数板、分光光度计、显微镜、生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅及玻璃器皿等。
培养基：推荐选用水生4号培养基，也可选用其它培养基，但要提供培养基名称和配方。
水生4号培养基配方：
硫酸铵 (NH4)2SO4 0.200 g
过磷酸钙 [Ca(H2PO4)2·H2O·（CaSO4·H2O）]饱和液 1mL 硫酸镁 MgSO4?7H2O 0.080 g 碳酸氢钠 NaHCO3 0.100 g 氯化钾 KCl 0.025 g 三氯化铁 FeCl3 1% 溶液 0.150mL 土壤浸出液 0.500 mL
蒸馏水 1000 mL
土壤浸出液用园田土和水以1?1混合，充分摇匀，静置澄清24 h，取上清液过滤。滤液高压蒸汽灭菌后贮存备用，使用期一年。
按以上配方配制成10倍的贮备液高压灭菌，使用时用无菌蒸馏水稀释。 待测样品的制备：可溶于水的样品用无菌蒸馏水配制成一定浓度的母液，置于冰箱内保存备用。难溶于水的样品可使用助溶剂、乳化剂或分散剂助溶，但助溶剂的浓度不得超过0.1 mL/L，且不能影响培养液的透光性。
藻种的预培养及培养条件：试验藻种以无菌操作法接种到装有培养液的三角瓶内，在规定的条件下培养。每隔96 h接种一次，反复接种2~3次，使藻类基本达到同步生长阶段，以此作为试验藻种。每次接种时在显微镜下观察，检查藻种的生长情况。在24?2?C，白色荧光灯连续光照下培养，光强4000~6000 Lux（?10%），也可以14?10或12?12光暗比光照。振荡培养或静置培养时，每天需
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定时摇动5~6次。
（2）试验方法
预试验：藻类的培养用250 mL三角瓶，每瓶中加入培养液100 mL，使其起始浓度达104个/mL，在无菌条件下培养。预试验的目的在于探明受试物质对藻类生长抑制的半抑制浓度EC50的大致范围，可以较大的间距设置4~5个浓度组，尽可能使EC50值落在所设置的浓度范围内。
正式试验：根据预试验的结果设置5~7个浓度组，并设一个空白对照组，使用助溶剂的还须增设溶剂对照组，各浓度组设3个重复。试验历时96 h，每隔24h取样，在显微镜下用血球计数板准确计数藻类的细胞数，或用分光光度计在波长600~750nm处直接测定藻类的吸光率。用血球计数板计数时，同一样品至少计数两次，如计数结果相差大于15%，应予重复计数。
（3）数据处理
确定受试物质的浓度与藻类生长抑制的浓度效应关系，可采用生物量比较法，也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。
生物量的比较：处理组藻类生物量抑制的百分率按下式计算：
B?N空白?N处理N空白 ?100式中，B—处理组生物量抑制的百分率，%；
N空白—空白对照组测定的藻类细胞数，个/mL； N处理—处理组测定的藻类细胞数，个/mL。
在半对数纸上以浓度对数为横坐标，以B为纵坐标，用直线内插法求出生物量抑制50%的毒物浓度，即为EC50。
（4）质量控制
① 试验用藻必须是处于对数生长期的纯种藻。
② 对照组和各浓度组的试验温度、光照等条件完全一致。 ③ 试验起始藻量应控制在1×104个/mL以内。 （5）评价标准
农药对藻类毒性等级分为三级（见表13）：
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