蛋白类药物生产工艺
蛋白质类药物是生化药物中非常活跃的一个领域，目前的生化产品主要是从动物脏器或组织包括人的血液中分离而得。20世纪70年代后，人们开始应用基因工程技术生产一些蛋白质药物，已实现工业化生产的产品如胰岛素、干扰素、白细胞介素、生长素、EPO、tPA、TNF等，现正从微生物和动物细胞的表达转向基因动植物发展。
第一节 主要蛋白质类药物的制备
蛋白质类药物主要包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等，其作用方式包括对机体各系统和细胞生长的调节、被动免疫、替代疗法等。 一、蛋白质激素类
蛋白质类激素主要包括垂体蛋白质激素、促性腺激素和其他蛋白质激素。其中垂体蛋白质激素包括 生长素(GH)、催乳激素(PRL)、促甲状腺素(TSH)、促卵泡激素(FSH)等。促性腺激素包括人绒毛膜促性腺激素(HCG)、血清促性腺激素( SGH )等。其他蛋白质激素包括胰岛素、胰抗脂肝素、尿抑胃素等。 (一) 生长素(growthhormone，GH)
生长素是动物脑垂体前叶外侧的特异分泌细胞分泌的一种促进生长的蛋白质激素，具有调节生长与发育的功能，对多种人类疾病有很好的疗效。
人生长素（human growth hormone，hGH）由一条191个氨基酸的多肽构成的一链多肽的球形蛋白质，分子中含两条二硫键，分子量为21700，等电点4.9，沉降系数S20，W 2.179，其活性不需要整个分子结构，N端1～134氨基酸为活性所必需，C端的肽链起到保护作用，其化学结构与催乳素近似，故生长素有弱催乳素作用，而催乳素有弱生长素作用。生长素包含大小两个环，以亲水球蛋白的形式存在。不同种类动物的生长素，其化学结构与免疫
264
性质等都有较大差别。生长素的生产工艺有传统的方法和基因工程技术方法。
1．生长素的传统生产方法
传统方法是从脑垂体前叶分离纯化，其生产工艺见图11-1所示。
前处理 脑垂体 垂体前叶 提取 硫酸铵 pH5.5离心 除盐 透析 Tris-HCl缓冲液 洗脱 透析内液 Sephadex G-75 pH8.5 活性组分 冻干 生长素 （-30℃） 透析内液 盐析沉淀 盐析硫酸铵 pH4.0离心 除杂蛋白 上清夜 离心 离子层析 透析内液 除盐 透析 DE-52 pH8.7 吸附DE-52 洗脱 硼砂-盐酸缓冲液 洗脱峰组分 透析内液 上清夜 分级沉淀 硫酸铵 pH7.5 溶解除盐 透析 盐析沉淀 透析 硼砂-盐酸液 pH8.7 图11-1 提取法生产生长素的工艺路线 传统的工艺过程如下:
① 材料获取 处死动物，立即解剖，取出脑垂体，冰上速冻，-20℃冷冻保存。 ② 预处理 脑垂体使用前，用蒸馏水冲洗数次，解冻，剥离前后叶。
③ 匀浆 取动物垂体前叶，分割成小块，加水，用硫酸铵调pH至5.5，置组织捣碎机中匀浆。
④提取 对匀浆以水抽提，10 000rpm离心30min；取沉淀，以pH 4.0的0.1mol／L硫酸铵溶液抽提，离心（同上），取沉淀，再用pH 5.5的0.25mol／L的硫酸铵溶液抽提，离心，取上清抽提液。
⑤沉淀 调节抽提液pH 7.5，加饱和硫酸铵溶液至硫酸铵浓度为lmol／L，离心，取上清液。
⑥再沉淀 对上清液再加饱和硫酸铵溶液至1.8mol／L，离心，得沉淀。 ⑦除盐 将沉淀溶于少量蒸馏水中，对蒸馏水进行透析，得透析内液。
⑧等电点沉淀 将所得透析内液用HCL或NaOH分别依次于pH 4.0和pH 4.9进行等
265
电点沉淀以除去杂蛋白，离心、取上清液。
⑨盐析 调上清液pH为4.0，加饱和硫酸铵溶液至浓度为1.25mol／L盐析，离心，得沉淀物。
⑩除盐 将沉淀物溶于少量蒸馏水中，对含0.1mol／L氯化钠的Tris-HCL (pH 8.5) 缓冲溶液进行透析，得透析内液。
⑩凝胶过滤 透析内液上Sephades G-75凝胶柱，用含0.1 mol／L氯化钠的50mmol／L Tris-HCL (pH 8.5 )缓冲溶液进行洗脱，分步收集，活性GH存在于第Ⅱ峰中。
⑩透析 将活性峰部分对6.5mmol／L的硼砂-盐酸(pH 8.7)缓冲溶液进行透析，得透析内液。
⑩层析 将透析内液上DEAE-C(DE-52)柱，用含0～0.3mol／L氯化钠的6.5mmol／L硼砂-盐酸 ( pH 8.0 ) 缓冲溶液进行梯度洗脱，合并活性峰，脱盐，冻干得GH。
2．人生长素的基因工程法
hGH的种属特异性很强，动物生长激素不能用于人，所以开始时hGH的惟一来源是从人尸体的脑垂体中取得，来源困难，价格昂贵，应用受到限制。目前已利用基因工程技术生产出hGH，美国的Genentech公司利用枯草杆菌系统表达的hGH产量高达1.5g/L，这也是第一代重组人生长激素，商品名称为Protropin.
生产路线如图11-2所示。
构建高效分泌型工程菌 种子培养 发酵培养 离心 粗提 生长激素 DEAE色谱 S-100色谱 Phenyl色谱 G-25色谱
（1）工艺过程如下：
266
图11-2 利用基因工程菌生产生长素的工艺路线（）
① 工程菌的构建 利用基因工程技术构建高效分泌型基因工程菌株，在生长激素的N-端增加分泌信号肽序列，使表达合成的重组人生长激素结构和天然人生长激素完全一致。
② 菌种繁殖 采用M9培养基，添加CAA(酪蛋白氨基酸)，调节pH 至7．0，置于摇床上，30℃，进行菌种培养繁殖。
③发酵 培养基同菌种繁殖培养基，种子培养过夜，开始进行发酵，时间一般为16~18h，温度为37℃，pH7.0~7.5，溶解氧不能低于20%。
④补料发酵 在发酵进行5~7 h后，需要适量补充葡萄糖、酵母浸出物、氮源、CAA、无机盐和微量无素，如PO43-、Fe2- 、Co2- 等离子，通过添加补料，可使菌体生长的对数期延，发酵菌体产量增加了一倍。其余的发酵条件与上述条件相同，菌体生长至稳定期放罐。。
⑤离心 将发酵菌体进行冻融破碎，按一定比例，加入预冷的由10 mmol/L Tris和1mmol/L EDTA组成的缓冲溶液（pH 7.5），80rpm搅拌1h，离心，收集上清液。
⑥粗提 在上清液中加入硫酸铵至饱和浓度45%，4℃放置2h，10000rpm离心30min，收集沉淀。
⑦脱盐 沉淀用10 mmol/L Tris和1mmol/LEDTA组成的pH值为8.0的缓冲溶液溶解，用Sephadex -G25脱盐。
⑧纯化 采用Phenyl-Sepharose，DEAE-Sepharose进行色谱，再加入固体硫酸铵达到饱和浓度45%，沉淀2h，离心，收集沉淀，溶解沉淀，再通过sephacryl S-11HR及DEAE-Sepharose进行纯化，得到人生长激素原料药半成品.。
（2）质量检验：质量必须符合<中华人民共和国药典>2005年版二部附录规定。 目前，人和动物生长素基因都已在大肠杆菌中表达成功，重组人生长激素将会得到大规模的生产，从而造福人类。 (二) 胰岛素 ( insulin )
胰岛素是胰脏中胰岛β细胞分泌的一种蛋白质激素，它是促进合成代谢的激素，在调
267
节机体糖代谢、脂肪代谢、核蛋白质代谢方面都有重要作用，是维持血糖在正常水平的主要激素之一。广泛存在于人和动物的胰脏中，正常人的胰脏约含有200万个胰岛，占胰脏总质量的1.5％。胰岛由α、β和δ三种细胞组成，其中α细胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素，β细胞制造胰岛素，δ细胞制造生长激素抑制因子。胰岛素在β细胞中开始时是以活性很弱的前体胰岛素原存在，进而分解为胰岛素进入血液循环，能使血糖降低，起到调节血糖作用。临床上主要用于治疗胰岛素依赖性糖尿病及糖尿病昏迷和酮症酸中毒、精神分裂症、休克等。
胰岛素由A、B两条链组成，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基，两链之间由两个二硫键相连，在A链内部含有一个二硫键。不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同，主要差别在A链二硫桥中间的第8位、9位和10位上的三个氨基酸及B链C末端的一个氨基酸上，随种属而异，但其生理功能是相同的。生产胰岛素的方法较多，有传统的方法和基因工程技术方法。
1．动物胰脏制胰岛素
由动物胰脏生产胰岛素的方法较多，目前被普遍采用的是酸醇法和锌沉淀法。现以酸醇法为例，介绍胰岛素的生产工艺。其工艺路线如图11-3所示。
提取
碱化
酸醇提取液 氨水pH8.0~8.4 碱化液 酸化
冻胰 刨碎 37℃，2h 胰片 乙醇，草酸pH2.5~3,12±2℃ 盐析 去脂 溶液 速热速冷 浓缩液 硫酸pH3.6~3.8 减压浓缩 30℃以下 酸化液 盐析物 除酸性蛋白 氯化钠pH2.0~2.5 水，丙酮，氨水pH4.2~4.3 锌沉淀 滤液 氨水，醋酸锌 pH6.0 沉淀 除碱性蛋白，结晶 柠檬酸，醋酸锌，丙酮，氨水 pH8.0,5℃以下过滤后调pH6.0 结晶 精制品 洗涤，干燥 水，丙酮，乙醚 图11-3 酸醇法生产胰岛素的工艺路线
（1）工艺过程如下：
268