／mg蛋白的水平。其工艺路线见图11-5。
氯化铵 灰黄层 抽取 血浆 正式诱生 人白细胞 启动诱生 37℃，12h IFN1 溶解 沉淀分离 沉淀3 NaOH pH8.0 PBS，KSCN 溶解pH7.0~7.5 沉淀4 PBS，NaOH 酸沉淀 上清液3 HCl pH3.0 沉淀5 溶解液 对PBS透析 pH7.0~7.5 溶解pH7.0~7.5 PBS，NaOH 溶解液 除盐 离心 透析清液 冻干 α-干扰素 IFN-β 上清液2 沉淀2 二次酸除杂蛋白 HCl pH5.5~5.8 上清液1 启动白细胞 仙台病毒 37℃，12h 白细胞培养物 2500r/min 离心分离 粗制 α-干扰素 KSCN，HCl 除杂蛋白 乙醇 5℃ 沉淀1 图11-5 诱生法生产干扰素的工艺路线
（1）工艺过程如下：
① 分离灰黄层 取新鲜血液400mL/份，加入ACD抗凝剂，离心，分离出血浆，小心抽取灰黄层。每份血可抽取13～15mL，放置4℃冰箱中过夜。
② 氯化铵处理 每份灰黄层加入30mL缓冲盐水，再加入9倍体积量的0.83％冷氯化铵，混匀，4℃放置10min，4℃离心(8000 r/min) 20min。弃上清液，加入适量缓冲盐水，收集沉淀细胞，制备悬浮液，重复上次处理，溶解残存的红细胞。取沉淀的白细胞悬于培养液中，冰浴保存，取样作活细胞计数。
③ 启动诱生 于白细胞悬浮液加入白细胞干扰素，使其浓度为100μg／mL，37℃水浴搅拌培养2h。
④ 正式诱生 启动后的白细胞加入仙台病毒(在10天龄鸡胚中培养48～72h，收获尿囊液)使其最后浓度为100～150血凝单位／mL，在37℃搅拌培养过夜。仙台病毒诱导人白细胞产生。
⑤ 收集 将培养物离心(2500 r/min) 30min，吸取上清液即得粗制干扰素。
⑥ 纯化 在粗制干扰素中加入硫氰化钾到0.5mol／L，用盐酸调pH为3.5，离心，得
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沉淀l。沉淀1加入原体积1／5量的冷乙醇( 94％)，离心，得上清液1。上清液1用盐酸调节pH 5.5，离心弃去沉淀，再调至pH 5.8，离心，得上清液2和沉淀2。沉淀2加入原体积1／50量的甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2)溶解，得IFNl。上清液2用NaOH调节pH值至8.0，离心，弃上清液，得沉淀3。沉淀3加原体积1／50量的0.lmol／L PBS和0. 5mol／L硫氰化钾(pH 8)溶解，pH值降至5.2，离心，得上清液3和沉淀4。 沉淀4加原体积1／25000量pH 为8.0的0.1mol／L PBS溶解，调至pH为7～7.5，对PBS ( pH 7.3)透析，过夜，离心，收集上清液，检测，得IFN-β。调节上清液3 pH值为3.0，离心，得沉淀5。沉淀5加入原体积1／5000量的pH 8.0，0.1mol／L PBS，加NaOH调节pH 7～7.5，对PBS ( pH7.3)透析过夜，离心，收集上清液，检测，得IFN-α。
（2）质量检验 我国用微量板染色的病变抑制法测定。国际上规定，能保护50%细胞免受病毒攻击的浓度即为一个IFN活性单位。
该法特点是一次纯化量大，回收率高于60％；经济，简便，易于普及，效价可达1.2×108U／mL，比活2.2×106 U／mg(蛋白)。IFN-α中干扰素含量占回收干扰素的82％，比活也比较高。
2．基因工程法
随着生物技术的发展，运用基因工程技术，已能在人体外大规模地生产人干扰素即基因工程干扰素。
目前，编码干扰素的基因已能在大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞中得到表达。α、β、γ三型基因工程干扰素都已研制成功，并投放市场，用于治疗的病种达20多种。我国卫生部已批准生产的干扰素品种有IFN-αlb、IFN-αⅡa、IFN-αⅡb和IFN-r四种。目前，人们在利用蛋白质工程技术研制活性更高，更适于临床应用的干扰素类似物和干扰素杂合体等各种新型干扰素。生产技术路线如图11-6所示。
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生产种子 成品检测与包装 制备种子液 发酵培养 提取 纯化 冻干 分装 半成品检测 半成品制备 图11-6 利用基因工程生产干扰素的工艺路线
① 基因工程菌的构建
首先从产生干扰素的白细胞中提取干扰素mRNA，对其进行分级分离。通过蟾蜍卵母细胞找出活性最高的mRNA，并用此mRNA合成cDNA。将cDNA与含四环素和氨苄抗性基因的质粒pBR322重组，转化大肠杆菌K12，得到重组子质粒。对每个重组子用粗提的干扰素mRNA进行杂交，把得到的杂交阳性克隆中的重组质粒DNA放到无细胞合成系统中进行翻译。对翻译体系的产物进行干扰素活性检测。再将干扰素的cDNA转入大肠杆菌表达载体中，转化大肠杆菌在特定条件下进行高效表达。其生产流程如图11-7所示。
诱生的白细胞 提取总RNA 通过寡dT-纤维素柱获得聚A的mRNA 5%~23%蔗糖密度梯度离心提取12S的mRNA 干扰素cDNA克隆在大肠杆菌中高效表达 杂交翻译法挑选含干扰素cDNA的克隆 筛选抗四环素但对氨苄西林敏感的细菌克隆 扩增杂交质粒 pBR322质粒 转化大肠杆菌K12 DNA的PstI酶切割段加dA退火获得杂交质粒 或dC mRNA逆转录成cDNA 双链cDNA用末端DNA转移酶接上dT或dG尾 图11-7 构建干扰素工程菌的一般流程
② 工程菌的发酵
a.种子制备 将构建的基因工程菌传代后于-70℃下甘油管中保存。如构建的人干扰素-αⅡb基因工程菌SW-IFN-aⅡb／E.coli-DHSa。质粒用PL启动子，含氨苄西林抗性基因。使用时进行活化。
b.种子罐培养 将菌种按1％种量接种到种子培养基，种子培养基的配方：1％蛋白胨、
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0.5％酵母提取物、0.5％NaCl；30℃摇床培养10h，作为发酵罐种子使用。
c.发酵罐培养 发酵培养基的配方：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.01％NH4Cl、0.05％NaCl、0.6％Na2HP04、0.001％CaCl2、0.3％KH2P04、0.01％MgS04、0.4％葡萄糖、50mg／mL氨苄西林、少量防泡剂。用15 L发酵罐进行发酵，发酵培养基的装量为10 L，pH 6.8，搅拌500 r/min，通风比为1：1／(m3·min)，溶氧为50％。30℃发酵8h，然后在42℃诱导2～3h完成发酵。同时每隔不同时间取2mL发酵液，在10 000 r/min离心除去上清液，称量菌体湿重。
在整个发酵过程中，要注意：（1）不同发酵阶段培养基的成分有差异；（2）培养液中要有足够的溶解氧，不同的培养阶段需要的溶解氧量也不同，通常通过增大搅拌速度，增加空气流量或者通入纯氧来满足条件；（3）发酵过程中在不同的阶段应控制不同的pH，发酵后期要降低pH，减少干扰素的水解；（4）要控制适当的温度，既要保证菌体细胞膜的完整和细胞中酶的活性，又要有利于提高干扰素的产量。
③ 产物的提取与纯化
a.提取 发酵结束后，冷却，离心(4000 r/min)，30min，收集沉淀，得湿菌体。取湿菌体悬浮于20mmol／L 的磷酸缓冲液(pH 7.0)中，冰浴中进行超声破碎，释放干扰素蛋白。4000 r/min离心30min，得沉淀，用含8mol／L尿素、20mmol磷酸缓冲液(pH 7.0)、0.5mmol／L二巯基苏糖醇溶液，室温搅拌抽提2h，然后15000 r/min离心30min。取上清液，用20mmol／L磷酸缓冲液(pH 7.0)稀释至尿素浓度为0.5mol／L，加二巯基苏糖醇至0.1mmol／L，4℃搅拌15h，15000 r/min离心30min，除去不溶物。上清液经截流量为104相对分子质量的中空纤维超滤器浓缩，将浓缩的人干扰素αⅡb溶液经过SephadexG-50分离，层析柱(2cm×l00cm)先用20mmol／L磷酸缓冲液(pH 7.0)平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分离，收集人干扰素αⅡb部分，经SDS-PAGE检查。
b．纯化 将Sephadex G-50柱分离的人干扰素αⅡb组分，再经DE-52柱(2cm×50cm)
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纯化，人干扰素αⅡb组分上柱后用含0.05mol／L、0.1mol／L、0.15mol／L NaCl的20mmol／L磷酸缓冲液(pH 7．0)分别洗涤，收集含人干扰素αⅡb的洗脱液。全过程蛋白质回收率为20％～25％，产品不含杂蛋白、DNA及热原质。干扰素αⅡb含量符合要求。 3．干扰素质量检验
基因工程干扰素半成品和成品均应作检测，包括干扰素效价、蛋白质含量及比活性、纯度测定 、相对分子质量、残余外源性DNA含量、残余血清IgG含量、残余抗生素活性 、干扰素效价测定、无菌试验、热原质试验。
成品检测：①物理性状 冻干制品外观应为白色或微黄色疏松体，加入注射水后，不得含有肉眼可见的不溶物；②鉴别试验 应用EIASA或中和试验鉴定,结果为阳性；③水分测定 用卡氏法，水分含量应低于3％。半成品也要进行无菌试验、热原质试验、干扰素效价；④安全试验 取体重350～400g豚鼠3只，每只腹侧皮下注射剂量为人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，则说明成品合格。
(二) 人红细胞生成素( rhEPO) 1．结构与性质
红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白，是调节红系祖细胞，对红细胞生成有特异刺激作用的细胞因子，在胎儿体内由肾脏及肝脏产生，在成人体内主要由肾脏分泌，在病理状态下，与多种贫血尤其与终末期肾脏疾病贫血密切相关。红细胞生成素有两种，天然人红细胞生成素和重组人红细胞生成素。天然人红细胞生成素是以人的尿、血等为原料，经生物化学方法纯化得到。重组人红细胞生成素是以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将人红细胞生成素的基因连接到表达载体上，转化CHO细胞，从细胞培养上清夜中纯化红细胞生成素。两种人红细胞生成素具有相同的体内体外活性，根据其糖基的不同，可以分为rhEPO-α和rhEPO-β两种。
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