① 提取 冻胰块用刨胰机刨碎，加入2.3～2.6倍的86％～88％乙醇(质量分数)和5％草酸，在12±2℃搅拌提取3h，离心。滤渣再用1倍量68％～70％乙醇和0.4％草酸提取2h，离心，合并乙醇提取液。沉淀用于回收胰岛素。
② 碱化、酸化 边搅拌提取液边加入浓氨水调pH 8.0～8.4 (12±2℃)，立即过滤，除去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至pH 3.6～3.8，降温至5℃，静置4h以上，使酸性蛋白充分沉淀。
③ 减压浓缩 吸取上清液至减压浓缩锅内，下层用帆布过滤，沉淀物弃去，取上清液，30℃以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液相对密度为1.04～1.06 (约为原体积的1／10～1／9为止)。
④ 去脂、盐析 浓缩液转入去脂锅内，5min内加热至50℃后，立即用冰盐水降温至5℃，静置3～4h，分离下层清液 (脂层用于回收胰岛素)。用盐酸调pH 2.3～2.5，于22±2℃搅拌加入27％(质量体积分数)固体氯化钠，保温静置数小时。析出物即为胰岛素粗品。 ⑤ 精制 盐析物按干重计算，加入7倍量蒸馏水溶解，再加入3倍量的冷丙酮，用4mol／L氨水调pH 4.2～4.3，然后补加丙酮，使溶液中水和丙酮的比例为7∶3。充分搅拌后，低温5℃以下放置过夜，次日在低温下离心分离，取上清夜，在上清夜中加入4mol／L氨水使pH 6.2～6.4，加入3.6％(体积分数)的醋酸锌溶液(浓度为20％)，再用4mol／L氨水调节pH 6.0，低温放置过夜，次日过滤，分离沉淀。
⑥ 结晶 将沉淀用冷丙酮洗涤，得干品，再按干品质量每克加冷2％柠檬酸50mL、6.5％醋酸锌溶液2mL、丙酮16mL，并用冰水稀释至100mL，使其充分溶解，5℃以下，用4mol／L氨水调pH 8.0，迅速过滤。滤液立即用10％柠檬酸溶液调pH 6.0，补加丙酮，使整个溶液体系保持丙酮含量为16％。慢速搅拌3～5h使结晶析出。在显微镜下观察，外形为正方形或扁斜形六面体结晶，再转入5℃左右低温室放置3～4d，使结晶完全。离心收集结晶，并小心刷去上层灰黄色无定形沉淀，用蒸馏水或醋酸铵缓冲液洗涤，再用丙酮、乙
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醚脱水，离心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得结晶胰岛素。
（2）质量检验 测定胰岛素效价，各国药典规定有家兔血糖降低法和小鼠血糖降低法。 （3）在整个生产过程中，为提高胰岛素的质量和产量，应注意以下几个方面： ① 胰脏质量是胰岛素生产中的关键，在我国是一个薄弱环节。工业生产用的原料主要是猪、牛的胰脏。不同种类和年龄的动物，其胰脏中胰岛素量有所差别，牛胰含量一般高于猪胰。采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断，并且离体后要立即深冻，先在-30℃以下急冻后转入-20℃保存备用，如用液氮速冻，效果更好。在胰脏中，胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提高收率10％。
② 浓缩 浓缩工序的条件，对胰岛素收率影响很大。如采用离心薄膜蒸发器，在第一次浓缩后，浓缩液用有机溶剂去脂，再进行第二次浓缩，被浓缩溶液受热时间极短，避免了胰岛素效价的损失。
③ 产品纯度 在常规的结晶胰岛素中，除了胰岛素主成分外，还含有其他一些杂蛋白抗原成份，如胰岛素原、精氨酸胰岛素、胰多肽等。因此要对结晶胰岛素进一步纯化，胰岛素原的含量显著降低。 2．人胰岛素的制备 （1）酶促半合成法
猪与人的胰岛素差别仅是B30位上的一个氨基酸，猪的是丙氨酸，人的则是苏氨酸。利用胰蛋白酶的转酰胺作用，将猪胰岛素转化为人胰岛素B30苏氨酸(丁酰基)丁酸，通过硅胶柱层析，然后用三氟乙酸处理，断裂保护基团，再用离子交换层析纯化，得到高纯度人胰岛素。
（2）利用基因工程技术制备
目前，国际上生产医用重组人胰岛素( recombinant human insulin, rhI)的方法主要有3种: 1)用基因工程大肠杆菌( Escherichia coli, E.coli)分别发酵生产人胰岛素( human insulin,
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hI)的A、B链。然后经化学再氧化法,使两条链在一定条件下重新形成二硫键,得到hI。这一方法缺点较多,目前已较少使用。
2)用基因工程E. coli发酵生产人胰岛素原( human proinsulin, hP I) ,后经加工形成h I。这种方法，E. coli系统表达量高,但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白,产物易降解,故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后,表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hI。
3)通过基因工程酵母菌发酵生产hP I,经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单,但缺点是生产慢,生产周期长,且重组蛋白分泌量少(1～50 mg/L) ,产量低。
工艺生产过程见图11-4。 ① 菌种
RRhP I/pQE-40 E.coli M15菌株 ② 培养基
培养基组成为：5g/L 胰蛋白胨,2g/L谷氨酸,7g/L酵母浸膏,0.5 g/L硫酸铵, 2.5 g/L葡萄糖, 2.7 g/L甘油,100mg/L 氨苄青霉素, 50mg/L卡那霉素, pH 7.2。
③ 一次发酵
将10 ml经过活化的RRhP I/ pQE-40 E.coliM15转移至100 ml培养基中进行培养, 活化菌种。
④ 发酵罐培养
将一次发酵液转移至含有1.5 L 培养基的发酵罐中进行发酵罐培养(转速为300 r/min,通气量为1∶1. 5～1∶1.8) ,一段时间后加入一定量新鲜的培养基并用NaOH 调节pH。在对数生长中期加入0.5mmol /L IPTG并升温诱导RRhPI表达4 h,转速随即调为400～500 r /min,增大通气量至1∶1.8～1∶2.0,继续培养一段时间后,收集菌体。
⑤ 包涵体的收集和洗涤
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将收集的湿菌体冻存于-20℃,然后悬浮于缓冲液A(50 mmol/L Tris-HCl, 0. 5 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaCl, 5%甘油, 0.1～0.5 mmol/LDTT,pH7.9) ( 5～6 ml/g湿菌)中,加入溶菌酶( 5 mg/g湿菌体) ,室温或37℃振荡2 h。冰浴超声10 s×30次,其间每次间隔20 s,功率为200W。10℃条件下1000 g离心5 min去除细胞碎片。上清液中的包涵体( Inclusion body, IB)在4 ℃条件下27000 g离心15 min收集,然后用含2 mol/L 尿素的缓冲液A充分悬浮,室温静置30 min后4 ℃条件下17000 g离心15 min,收集沉淀。沉淀再用含2%脱氧胆酸钠的缓冲液A充分悬浮, 4 ℃条件下17000 g离心15min,收集沉淀。最后沉淀用10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.3洗涤两次(4℃,17000 g离心15 min ) 。
⑥ RRhPI的初步纯化
将收集的IB用含有0.1%～0.3%β-巯基乙醇的缓冲液B( 30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L尿素, pH 8.0)溶解,上于已用缓冲液B平衡的DEAE-Sepharose FF柱,用合适的氯化钠梯度洗脱,收集含RRhPI的洗脱液。
⑦ RRhPI的重组复性
将初步纯化后的RRhPI通过Sephadex G-25脱尿素,转换缓冲液为不同pH的50 mmol/L Gly-NaOH重组液,或含有适量GSSG的Gly-NaOH缓冲液中,使蛋白终浓度为0.1～0.6 mg/ml,收集趋于正确折叠的RRhPI单体组分,加入适量GSH 和GSSG,4℃放置24 h。
⑧ 酶切转化
向RRhPI复性液中加入一定量的胰蛋白酶和羧肽酶, 37℃酶切一段时间,然后用0.1 mol/L ZnCl2 终止反应并沉淀生成的hI。
⑨ hI的纯化
将0.6g IB分别用含0.1%, 0.2%, 0.3%β-巯基乙醇的30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L尿素, pH8.0 溶解,进行DEAE-Sepharose FF 离子交换层析,然后将收集得到的RRhPI组分通过Sephadex G-25脱尿素以使RRhPI复性。
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构建工程菌 发酵 收集菌体 细胞破碎 离心 胰岛素粗品 取上清夜 离心 离子交换 收集沉淀 纯化的人胰岛素 离子交换、分子筛色谱、反相色谱、结晶 酶切解离 A、B链 胰岛素复性 胰岛素原 图11-4 利用基因工程菌生产人胰岛素的工艺路线（仿自李晓红，2007）
二、
蛋白质类细胞生长调节因子
蛋白质类细胞生长调节因子包括干扰素（IF）α、β，γ、白细胞介素1-18 (IL)，神经生长因子（NGF）、肝细胞生长因子(HGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，肿瘤坏死因子(TNF)，集落刺激因子(CSF)，组织纤溶酶原激活因子(t-PA)，促红细胞生成素(EPO)，骨发生蛋白(BMP)等。
(一) 干扰素（Interferon ,IFN）
干扰素指由干扰素诱生剂诱导有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能的诱生蛋白质。这类诱生蛋白质从细胞中产生和释放之后，作用于相应的其它同种生物细胞，并使其获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的“免疫力”，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性的作用，是人体防御系统的重要组成。人干扰素根据其来源细胞不同，分为白细胞干扰素(IFN-α)、类淋巴细胞干扰素(IFN-α与IFN-β的混合物)、成纤维细胞干扰素(IFN-β)、T细胞干扰素 (IFN-γ)等几类。按其抗原性的不同，分为α型、β型和γ型三种，同一型别，根据氨基酸序列的差异，又分为许多亚型，如常用的IFN-α包括IFN-αⅡa、IFN-αIb和IFN-αⅡb等亚型。干扰素具有沉降率低，不能透析，可被胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶破坏，不被DNase和RNase水解破坏等特性。
干扰素的生产方法有传统的体外诱生法和基因工程法。
1．传统的体外诱生法
传统的方法是通过体外诱生的方法获得干扰素。干扰素具有高度的种属特异性，临床使用的干扰素都用人的细胞制备，α-干扰素用人血白细胞或淋巴细胞制备；β-干扰素用人成纤维细胞制备。目前我国已完善了利用血库血大量制备人血细胞干扰素的方法，达到106U
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