2．生产工艺
获得人红细胞生成素基因 构建人红细胞生成素基因表达载体 人红细胞生成素表达细胞株的建立 重组细胞株的培养 人红细胞生成素的分离纯化 人红细胞生成素的活性检测 人红细胞生成素制剂 图11-8 利用基因工程菌生产人红细胞生成素的工艺路线
工艺路线如图11-8所示。
① 克隆并筛选人红细胞生成素基因 获得人红细胞生成素基因的方式有两种，一种提取人胚胎mRNA，逆转录合成cDNA文库，筛选文库，得到人红细胞生成素基因，也可以通过筛选人胚胎基因组文库获得。另一种是提取胚胎染色体DNA，通过PCR扩增获得基因片段，再体外拼接。
② 构建红细胞生成素基因表达载体 与编码红细胞生成素基因片段相连的表达载体有pDSVL、pSV2 和pD11。以构建携带编码人红细胞生成素基因的核苷酸序列（prEP）的质粒为例进行说明。从人胚胎中提取总RNA，逆转录合成cDNA, 进行文库筛选，得到人红细胞生成素基因，将该基因与载体在连接体系中过夜, 加入T4 DNA连接酶。挑取单菌落接种于5mL培养基，37℃过夜。
③ 建立红细胞生成素表达的细胞株 将重组质粒导入哺乳动物细胞，经筛选得到所需要的细胞系，冻存备用。
④ 重组细胞株的培养 将冻存的细胞株取出，37℃水浴解冻，离心，弃去冻存液。采用转瓶培养细胞，将解冻的细胞株接种于适量的DMEM培养基，37℃、CO2培养箱中培
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养，连续传代三次。采用消化酶将细胞消化，使细胞浓度为2.5×106个/mL，接种。采用生物反应器培养重组细胞株，采用DMEM培养基，加含小牛血清，控制条件pH 7.0、搅拌速度小于50 r/min, 37℃、DO为50％～80％，使细胞贴壁；细胞贴壁后提高转速80～100 r/min，培养10d；更换无血清培养基在进行灌流培养，在此过程中，连续收获培养液，在4℃～8℃保存。
⑤ 红细胞生成素的分离纯化 采用三步法纯化红细胞生成素，将培养液通过滤膜过滤，上CM-Sephrose亲和色谱柱，CM柱预先用Na-HAc-异丙醇活化，20mmol/L Tris-HCL平衡缓冲液平衡，然后用0～2mol/L Tris洗脱液洗脱，收集洗脱峰，10mmol/L Tris透析液中透析过夜。透析过程中，透析液的体积为蛋白液体积的15倍，换液4次，0.22um滤膜过滤。活性组分上平衡过的DEAE离子交换柱，0～1mol/L NaCL-HCL洗脱液洗脱，收集活性洗脱峰，再上10％乙腈平衡的RP-HPLC柱，10％～70％的乙腈洗脱液洗脱，收集活性洗脱峰，再用20mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡凝胶柱，并进行洗脱，收集活性洗脱峰，即为红细胞生成素。
⑥ 红细胞生成素的活性检测 红细胞生成素的活性可以通过放射免疫分析和体内生物活性分析，体内生物活性的测定可以采用网织红细胞计数法。
在生产过程中，重组细胞株的培养必须要注意是无菌条件、温度37℃、气体交换可靠、pH稳定7.0～7.2、葡萄糖是必不可少的碳源，另外采用生物反应器时要能及时添加培养液保证连续培养、载体要有足够的表面积，使得细胞株得以高密度、高表达连续培养。 （三）白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)
白细胞介素(interleukin，IL) 由白细胞或其他体细胞产生的又在白细胞间起调节作用和介导作用的一类细胞因子，是淋巴因子家族的一员。目前已有IL-1～18。许多白细胞介素不仅介导白细胞的相互作用，还参与其他细胞如造血干细胞、血管内皮细胞、纤维母细胞、神经细胞、成骨细胞和破骨细胞等的相互作用。IL-2主要由T细胞或T细胞系产生，脾脏、
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淋巴结和扁桃腺中的T细胞受到刺激后都能产生IL-2，人和动物某些T细胞白血病细胞系或肿瘤细胞在有丝分裂原、钙离子载体(如 A23187) 或PMA刺激下可产生高水平的IL-2。
白细胞介素的生产方法有传统的体外诱生法和基因工程法。 1. 白细胞介素-2的传统生产方法
IL-2是由辅助T细胞经抗原或有丝分裂原等刺激，在巨噬细胞或单核细胞分泌的IL-1参与下，产生并分泌的含133个氨基酸的糖蛋白，分子量为15420。在pH为2～9范围内稳定，56℃ 1h内仍具有活性。临床上主要用于治疗一些免疫功能不全及癌症的综合治疗。白细胞介素-2的传统生产方法是通过诱生的方法获得。工艺路线如图11-9所示。
诱生 人血 白细胞 透析 透析内液 亲和层析 sepharose4B柱 亲和载体1 解吸 洗涤 亲和载体2 1.0mol/L NaCl的PBS IL-2活性组分 凝胶层析 凝胶载体 上Utrogel柱 10mmol/L PBS 收集沉淀 鸡瘟病毒和PHA 诱生白细胞 培养液 除杂蛋白 调节酸度 离心 沉淀 硫酸铵 上清液 硫酸铵 离心 上清液 0.4mol/L NaCl的PBS 浓缩洗脱 白细胞介素-2成品 0.2mol/L Tris-HCl含PEG、正丁醇0.2mol/L甘氨酸 图11-9 诱生法生产白细胞介素-2的工艺路线
① 诱生 用加入鸡瘟病毒和PHA的培养液培养人外周血白细胞，这两种物质起到联合刺激的作用，37℃培养。
② 除变性蛋白 用6mol／L HCl调节pH2.0～2.5，再用6mol／L NaOH调回到pH7.2～7.4，离心除去变性杂蛋白。
③ 硫酸铵分级沉淀 取上述离心后的培养上清液，加饱和硫酸铵至35％饱和度，4℃静置24h，离心弃去沉淀。上清液补加固体硫酸铵至85％饱和度，4℃静置24h，离心，收集沉淀。
④ 透析 将沉淀溶于pH 6.5、10mmol／L PBS中(内含2％正丁醇和0.15mol/L NaCL)。
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对pH 6.5、10mmol／L PBS透析24h(更换5次透析外液)。
⑤ 蓝色琼脂糖层析 将上述透析内液通过Sepharose4B层析柱，用PBS洗去不吸附的蛋白，再用含0.4mol／L NaCl的PBS洗涤亲和柱，最后用含1.0mol／L NaCL的PBS解吸IL-2活性组分。
⑥ 凝胶层析 将解吸的IL-2活性组分经分子量为6000的PEG浓缩，再上ACA44U1-trogel层析柱。柱用含0.1％PEG、2％正丁醇和pH7.6的0.5mol／L甘氨酸的0.2mol/L Tris-HCL洗脱，得IL-2。
2．基因工程IL-2的制备
目前国内用酵母、动物细胞培养和用大肠杆菌基因重组的IL-2都已批准生产，并用于临床。重组IL-2的获得过程中，已成功地利用大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞来表达重组人IL-2，但在大量生产重组IL-2中主要是使用大肠杆菌。 ① 基因工程菌的构建
从ConA激活的人白血病T细胞株提取高活性IL-2的mRNA作为模板，逆转录单链cDNA，经末端脱氧核苷酸转移酶催化，在cDNA末端连接若干dCMP残基，再以寡聚(dG)12～18为引物，利用DNA聚合酶I成双链cDNA，经蔗糖密度梯度离心法分离出此cDNA片段。通过GC加尾法将此cDNA片段插入到pBR322质粒的PstI位点，用重组质粒转化大肠杆菌K12株X1776，得到IL-2的cDNA文库。利用mRNA杂交试验筛选IL-2 cDNA文库得到含IL-2 cDNA质粒的菌株。已有一些携带人突变型白细胞介素2 ( IL-2) 的质粒，如pPIC9K等。
② 基因工程菌的发酵
将IL-2 工程菌接种于含氨苄青霉素的2 mL YPD 培养基中, 过夜培养, 以1 %接种入含100 mL BMGY的500 mL 三角瓶。30℃ 300 r/ min 培养至OD600 = 3～6 (大约16～18 h)。弃上清液并将菌体细胞沉淀悬浮在1/ 5 到1/ 10 原初始培养液体积的BMMY培养基中,0.5 %
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到5 %甲醇诱导。在此过程中优化表达条件, 如通气状况、诱导时间（表达量随时间延长逐渐增加,培养48 h 达到高峰值）、初始pH 值、甲醇终浓度（目的蛋白量在甲醇浓度为1%时达到最高）等。外源蛋白在甲醇酵母中的表达分2步, 即菌体生长和蛋白诱导表达。先在以甘油为碳源的培养基上培养菌体, 达到一定OD 值后, 离心, 弃去上清液, 菌体悬浮于以甲醇为碳源的培养基中诱导表达, 每隔24 h 加1次甲醇, 以弥补甲醇的损失。
③ IL-2的分离
IL-2基因工程菌经发酵培养和诱导表达后，发酵液离心，收集菌体。菌体悬浮于PBS溶液中，超声破碎，离心沉淀，用PBS洗3次，尽量去除杂蛋白及核酸，离心粗制包涵体，包涵体主要含由IL-2单体分子聚合而成的多聚体，不溶于水，且其中的重组IL-2无生物活性。
④ 蛋白溶解
包涵体经常出现不溶解现象，使用高性能分散机，瞬间打开分子间的化学键，有利于变性剂继续打开蛋白质分子间和分子内的化学键，使蛋白完全溶解。可用6mol／L盐酸胍或8mol／L脲或尿素使包涵体变性解聚成单分子(变性后仍无生物学活性)。
⑤ IL-2的复性
采用50μmol/L CuSO4的含有PBS的溶液与IL-2粗品以1：50体积混合后, 置室温过夜。。也可利用空气氧化，或还原型谷胱甘肽复性，恢复IL-2二硫键和正常分子结构，获得生物学活性。
⑥ 提高IL-2的复性率
在复性过程中,只有60%～70%的IL-2 能正确配对,另有30%～40%的IL-2 则会形成错配体和二聚体,收集生产过程中经高效液相色谱洗脱下来的错配体和二聚体（色谱峰的左部分）进行重新氧化复性,可以使IL-2的回收率提高20%以上。
⑦IL-2的纯化
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