⑶Ⅰ号培养基是为了获得更多的菌株，属于通用培养基，Ⅱ号培养基是为选择出SP1菌株属于选择培养基，Ⅱ号培养基成分中含N物质为硝酸铵，则应由它为SP1菌株提供氮源； ⑷在恶劣环境下一些菌体会形成芽孢休眠体，来度过不良环境；
⑸SP1菌株是以氯苯为碳源，当氯苯消耗尽菌株因缺少碳源而不能继续生存，故氯苯含量越少，SP1菌株越早停止生长。 答案： （1）琼脂
（2）先调PH，后灭菌
（3）通用 选择 硝酸铵 （4）芽孢
（5）20mg/L氯苯 氯苯最早耗尽
十九、微生物的接种以及菌落和抗生素抑菌现象的观察 材料选择
大肠杆菌、枯草杆菌、滕黄八叠球菌等细菌菌种及其悬液 ◇仪器和试剂
接种环、无菌滴管、无菌玻璃刮铲、镊子、记号笔、直尺、酒精灯、牛肉膏蛋白胨固体培养基、分别浸过不同浓度抗生素和无菌水的圆纸片 ◇实验方法
一、接种和菌落观察
1．将菌种和接种用具置于启动的超净工作台上5～10 min。
2．点燃酒精灯，打开菌种试管封口后将管口在火焰上烧一下，并将试管口置于火焰附近，然后灼烧接种环，将接种环于菌种试管培养基无菌落处冷却后刮取少许菌苔，将菌苔用划线法涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基表面。注意转动培养皿，在三个方向上划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落(图1—23)。
3．倒置培养皿，于37℃下培养2～3 d后观察和比较各种细菌菌落的形态。 二、抗生素对微生物的抑制作用
1．用三支无菌滴管分别吸取上述三种细菌的悬浮液1～2滴，滴于三个平板培养基表面，然后分别用三个无菌玻璃刮铲涂匀。
2．用无菌镊子将分别浸过不同浓度的某种抗生素和无菌水的圆纸片(沥干的)均匀置于上述三个平板培养基表面(事先已在培养皿底部用记号笔做好记号)。
3．在37℃恒温箱中培养2～3 d后，在培养皿底部用直尺测量每个圆纸片周围清晰区的宽度，并记录。
有超净工作台的学校，上述实验在超净工作台上进行效果更好。
11
常用的接种方法有以下几种：
1. 划线法 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。
2. 点接法，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
菌落介绍：
菌落（colony）单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度形成肉眼可见有一定形态结构的子细胞的群落。
将分散的细胞或孢子接种到培养基上，在适宜条件，使其生长繁殖。由于细胞受到固体培养基表面或深层的限制，子代菌体常以母细胞为中心聚集在一起，形成具有一定形态结构的子细胞群体。各种微生物在一定条件下形成的菌落特征（如大小、形状、边缘、表面、质地、颜色等）
具有一定的稳定性，是衡量菌种纯度、辨认和鉴定菌种的重要依据。菌落特征与微生物的菌体形态结构特征密切相关。例如细菌、酵母菌不形成菌丝，其菌落仅生长在固体培养基表面，可用接种工具将其全部挑起，即与培养基结合不紧密；而放线菌、霉菌的菌体大多
12
分化为营养菌丝与繁殖菌丝，其营养菌丝深入培养基中吸取营养，故具有与培养基结合较紧，不易挑起等特征。
抑菌圈测量介绍：
抑菌圈测量是微生物分析的经典方法。它是利用抑菌物质在涂布特定试验菌的琼脂培养基内成球形立体状扩散，抑制试验菌的繁殖，在抑菌物质的周围形成透明圈，即抑菌圈。抑菌圈越大说明该细菌对此抑菌物质敏感性越大，反之越小。
抑菌圈测量目前得到了广泛应用，如：抗生
素的效价测定；新药的筛选；抑菌活性菌株的筛选；材料抗菌作用的研究；植物抑菌活性的筛选研究；抑菌保鲜作用的研究等等。
小课题：用选择培养基分离土壤中的自生固氮菌 1．从土壤分离自生固氮菌的实验步骤。
(1)土壤取样：通常从菜园土表3～5 cm以下的土层中取土壤样品。
(2)土壤样品稀释：通常取土壤10g，放入无菌研钵中，注入无菌水5 ml，并用无菌玻璃棒搅拌均匀，备用。上述过程在超净台上操作。
(3)培养基配制：分离自生固氮茵的培养基，通常采用无氮培养基。在这种培养基上，其他类型的微生物不能生长，而自生固氮菌能利用空气中的N2作为氮源进行生长。
阿什比无氮培养基成分：葡萄糖10 g、磷酸二氢钾0.2 g、硫酸镁0.2 g、氯化钠0.2 g、硫酸钙5 g，蒸馏水1000 ml，pH7.0。
培养基加入1％琼脂(需用自来水流水冲洗几天，再用蒸馏水浸泡，洗涤几次，以除去琼脂中的氮)制成固体培养基，经高压灭菌后备用(方法见实验1.2)。
(4)接种方法：在超净台上，将接种环在火焰上灭菌后冷却，蘸取少许上述稀释液，轻轻地点在无氮培养基表面，共点接15～20处；也可采用划线法接种(方法见实验1．3)。 (5)培养：接种后，将培养皿倒置，放在28～30℃恒温箱中培养3-4 d。 注意：培养时间不宜过长，否则菌落会分泌含氮化合物，引起杂菌生长。 (6)观察：观察菌落的形状、大小和颜色。
(7)镜检(选做)：取一片酒精消毒处理过的载玻片，烘烤后冷却，在中央滴一滴无菌水；用灭过菌的接种环从单个茵落中挑取少许菌涂在水滴中央，加一滴结晶紫液(0.1 g结晶紫溶解在100ml水中制得)染色1min；另取一片载玻片倾斜30°～45°，从液滴左侧向右侧移动，然后自右向左推移，推出一层均匀的菌膜，制成临时涂片；让涂片自然干燥后，在高倍镜下观察，被染料染成紫色的细菌是自生固氮茵。自生固氮菌通常呈杆状或短杆状，周
13
围有荚膜，常常两个细胞连在一起。
(8)纯化(选做)：在超净工作台上用灭过菌的接种环挑取单个茵落，接种在阿什比无氮试管培养基上，经培养后冷藏在冰箱中保存。
2．小课题影响因素的设计 (1)土壤取样：
①从不同深度土层取样，如地表以下4 cm、8 cm； ②从不同的土壤取样，如壤土、砂质土。
(2)土壤样品稀释度：土壤样品10 g，注入无菌水5 ml、10 ml。 (3)接种方法：如点接法、划线法。
二、生物实验涉及基本技术归纳 1、玻片标本的制作
（1）压片法，例如洋葱根尖细胞的有丝分裂 （2）装片法，例如高倍镜下观察质壁分离和复原 2、研磨、过滤，例如酶、色素等 3、纸层析技术，例如叶绿素的分离等 4、恒温技术，例如酶参与的生化反应等
5、解离技术，例如细胞壁的破环、有丝分裂装片的制作等 6、比色技术，例如还原糖、脂肪和蛋白质含量的鉴定等
7、最常见的经典的实验方法汇总如下（在各种实验中常常用到）： A．化学物质的检测方法
(1)淀粉——碘液
(2)还原性糖——班氏试剂
(3)CO2——Ca(OH)2溶液或酸碱指示剂 (4)乳酸——pH试纸 (5)O2——余烬木条复燃 (6)无O2——火焰熄灭 (7)蛋白质——双缩脲试剂
(8)染色体——龙胆紫、醋酸洋红溶液 (9)脂肪——苏丹Ⅲ
B．实验结果的显示方法（详见课件）
(1)光合速率——O2释放量或CO2吸收量或淀粉产生量 (2)呼吸速率——O2吸收量或CO2释放量或淀粉减少量 (3)原子途径——放射性同位素示踪法 (4)细胞液浓度大小——质壁分离
(5)细胞是否死亡——质壁分离、亚甲基蓝溶液染色 (6)甲状腺激素作用——动物耗氧量，发育速度等
(7)生长激素作用——生长速度（体重变化，身高变化）
14
(8)胰岛素作用——动物活动状态
(9)菌量——菌落数或亚甲基蓝溶液褪色程度 (10)大肠杆菌——伊红-美蓝琼脂培养基
C．实验条件的控制方法（详见课件）
（1）增加水中氧气——泵入空气或吹气或放入绿色植物 （2）减少水中氧气——容器密封或油膜覆盖或用凉开水 （3）除去容器中CO2——NaOH溶液或KOH溶液
（4）除去叶片中原有淀粉——至于黑暗环境一昼夜 （5）除去叶片中叶绿素——酒精加热
（6）除去光合作用对呼吸作用的干扰——给植株遮光 （7）如何得到单色光——棱镜色散或彩色薄膜滤光 （8）血液抗凝——加入柠檬酸钠 （9）线粒体提取——细胞匀浆离心
(10)灭菌方法——微生物培养的关键在于灭菌，对不同材料，灭菌方法不同：培养基用高压蒸汽灭菌；接种环用火焰灼烧灭菌；双手用肥皂洗净，擦干后用75%酒精
消毒；整个接种过程都在实验室无菌区进行。
D．实验中控制温度的方法
(1)还原糖鉴定：加热煮沸 (2)酶促反应：水浴保温
(3)用酒精溶解叶中的叶绿素：酒精要隔水加热 (4)细胞和组织培养以及微生物培养：恒温培养
三、生物学中常用的试剂和药品 1.染料及染色剂
（1）染料：按染色对象分为胞核染料（龙胆紫、醋酸洋红），脂肪染料（苏丹Ⅲ）等。 （2）染色剂：染料溶解在溶剂中而成的溶液。如醋酸洋红液、龙胆紫溶液、亚甲基蓝溶液（活体染色）、红墨水等。 2.掌握几种制剂的作用
（1）2，4-D生长素类似物：有双重性，低浓度促进生长；高浓度抑制生长；培育无籽果实。
（2）秋水仙素：a.诱发基因突变。b.使染色体加倍，培育多倍体。c. 单倍体育种，培育纯种。
（3）0.9%生理盐水（维持红细胞、口腔上皮细胞形态），10%KNO3溶液（植物细胞质壁分离和自动复原），20%盐酸溶液（对根尖解离），丙酮、酒精（溶解色素），层析液（分离色素），龙胆紫溶液、醋酸洋红液（根尖细胞染色体染色），30%蔗糖溶液（植物细胞质壁分离和复原）
（4）紫外线：一定剂量可作为能量、保温，高剂量可导致细胞基因突变。
15