对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究
贺磊（同组：胡宝军） 浙江工业大学生环学院，生工0901
摘要：
目的 学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。方法 蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。
结果 通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。通过这一系列的实验，使学生的实验好奇心得到了增强，提高了学生的动手能力，为将来进一步学习及实验打下基础。
关键词：蔗糖酶，Q Sepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE
在实验教材《生物化学技术实验指导》的指导下，学习测试与研究蔗糖酶的相关技术。其中从蔗糖酶的提取及初步
提纯开始，进一步到蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。这一系列实验均比较基础，给我们的将来的实验奠定了技术上的支持。
1. 实验1. 蔗糖酶的提取及初步提纯 1.1材料与方法 1.1.1试剂
①新鲜的啤酒酵母（冰冻在冰箱内，由实验室从啤酒厂买来）；
②醋酸钠（AR）； ③甲苯（AR）； ④4mol/L醋酸； ⑤95%乙醇（<-20℃）；
⑥0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。称取121.1g Tris溶于1500ml的蒸馏水中，用4 mol/L HCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水稀释到2L，即为0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。
⑦0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液：将0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液稀释10倍即得。
注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。
1.1.2器材
①锥形瓶250ml（×1），50ml（×1）；
②量筒10ml（×1）25ml（×1）; ③烧杯100 ml（×1），1000 ml（×1）； ④具塞试管10 ml（×3）； ⑤吸球、玻棒、滴管、pH试纸； ⑥培养箱； ⑦恒温水浴箱；
⑧磁力搅拌器，搅拌子； ⑨高速冷冻离心机。
1.1.3操作方法 1． 酵母的自溶
在250ml锥形瓶中加入冰冻的啤酒酵母20g、醋酸
钠1.6g，搅拌15~20min，使团块的鲜酵母液化，加1.5ml甲苯用大小合适的软木塞将瓶口塞住，摇动10min使甲苯和酵母液充分混匀，放入37℃培养箱中保温60h，使酵母自溶。
因本实验采用的是啤酒酵母，故酵母自溶时散发着
浓烈的酒香。经自溶后，酵母液得到颜色加深。 2． 初提取液A
在培养箱中取出装有已自溶酵母的锥形瓶，加10ml
蒸馏水，摇匀，倒入塑料离心管中，平衡（分给同学酵
母液少许少许）后用高速冷冻离心机4℃、15000r/min离心10min。经离心一次后，离心管中的悬液分两层，上层为黄褐色浆状液体，下层为固体，呈斜面状。取上层液体后再次离心，再取上层液体记体积为VA=12.5ml。 3． 热提取液B
取出3ml液体后倒入50ml锥形瓶中，加入3.2ml4mol/L的HAc，摇匀后入50℃水浴中30min。溶液的颜色变浅，呈乳黄色。迅速放入冰块中冷却，倒入离心管中，用水平衡（对方加水的）后离心，得VB=11.0ml。
4． 乙醇沉淀提取液C
将热提取液B 倒入100ml小烧杯中，将烧杯放入冰浴中边搅拌边缓慢滴加98%的冰乙醇，30min后继续搅拌5min，离心，平衡（用50%的乙醇，对方加），用0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液溶解烧杯中的固体，与离心管中固体一起再次离心，得Vc=5.3ml。 1.2结果与分析 1.2.1结果
VA总=VA=12.5ml
VB总=VB·[VA/(VA-3)]=14.5ml VC
总
=Vc·[VA/(VA-3)] ·[VB/(VB-3)]=Vc·[VB
总
/(VB-3)]=9.6ml。 1.2.2分析
酵母菌自溶的时间超过60h不可太多，否则可能使蛋白酶进一步自溶，酶量减少。
也可以用其他酵母品种。如酵母粉（超市有售），可使采购原料、实验操作更为简便。 1.3结论 VA总=12.5ml VB总=14.5ml VC总=9.6ml。 1.4注意
①第一次离心后取液体时要小心。重新离心后倒出
液体留下固体。
②水浴时的温度不要超过50℃。同时在保温过程中不断摇动锥形瓶。冰浴时要迅速操作。
③冰浴操作过程中加缓冲液使固体充分溶解，减少损失。
2．实验2. 蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法 2.1材料与方法 2.1.1试剂
①0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；
②1mol/LNaCl的 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；