③0.5mol/LNaOH；
④Q Sepharose，长期保存需置于20%乙醇中，4℃保存。
注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。 2.1.2器材 ①层析柱；
②梯度混合器;
③磁力搅拌器，搅拌子； ④紫外分光光度计； ⑤点滴板；
⑥尿糖试纸、擦镜纸； ⑦止水夹； ⑧烧杯、试管。
2.1.3操作方法
1． 离子交换柱的填充
将层析柱垂直固定，加水，排除气泡，再加少量水，装入离子交换剂，至柱高5cm，交换柱上端保留少许水（不得干柱）。
2． 缓冲液盐度梯度发生器的安装
两个杯子的左边一个杯子内加25ml含NaCl的 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液，右边25ml的Tris-HCl pH7.3缓冲液（不得装反），排除气泡（为了保证连通），在低浓
度一段装入搅拌子。
3．柱的平衡
将柱子与恒流泵连通，用25ml Tris-HCl pH7.3缓冲液进行冲洗平衡完成后，交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。
4．加样
将缓冲液放至刚好与交换剂相切，取0.5mlC液，加入交换柱，再放至刚好与交换剂相切，夹紧夹子，上方需加5ml左右的缓冲液。
以每管3ml收集加样后液体。共收集11管液体（记为1~11号）。
5．洗脱
为防止液面低于交换剂表面，加入了5ml缓冲液。
①
0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液25ml洗穿透峰。收集8试管液体（记为12~19号）。
②
连通梯度发生器。无意中开关旋转过度，使NaCl的 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液没有与Tris-HCl pH7.3缓冲液混合，故仍为上一步的洗穿透峰，收集3管（记为20~22号）。及时调整后，收集8管液体（记为23~30号）。
③
离子交换柱的再生。
6．测OD值
在紫外分光计光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值。
得到各管的OD值如下：
试管号 OD值 试管号 1 0.000 18 2 0.053 19 3 0.216 20 4 0.157 21 5 0.024 22 6 0.020 23- 7 0.010 24± 8 0.007 25++ 9 0.011 26+++ 10 0.061 27+ 11 0.138 28 12 0.134 29 13 0.073 30 14 0.143 31 15 0.082 32 16 0.181 17
0.155
注:用+-表示酶活力+多活力大。
OD值 0.054 0.072 0.095 0.105 0.120 0.111 0.161 0.272 0.295 0.235 0.235 0.014 0.038 0.027 0.043
7．酶活力测试
用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小，由以上OD值，取23到27组。 19管进行测试。
酶活力测试方法：在点滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待测洗脱液，用玻璃棒搅匀，放置5min，浸入葡萄糖试纸，1s后取出，60s比较颜色深浅。
结果得到25、26号活力最大。 将其合并成一管，VD=5.4ml 2.2结果与分析
2.2.1结果 VD =5.4ml
VD总=VD·VC总/V样=5.4×9.6/0.5=103.6ml。 由数据得表如下：
Q Sepharose-柱层析法提纯酶数据处理表
2.2.2分析
本法用的Q Sepharose凝胶是以琼脂糖作为不溶性母体引入季铵型基因，为强阴离子交换剂。Q Sepharose凝胶交换介质质量高，分辨率高，能承受较高的流速，化学性质稳定性好。在pH7左右时，Q Sepharose凝胶带正电，而一般蛋白质在此酸度范围带负电，两者可结合，降低Phh或提高离子强度均可以使之洗脱下来，当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时，达到分离的目的。
装柱时不得干柱。此次试验中由于不慎，可能存在干柱的嫌疑。不过及时又添加了 Tris-HCl pH7.3缓冲液，对本次试验的结果影响减到了较小的程度。
梯度发生器第一次失误的过程，结果相当于多做了洗穿透峰。
在以每管3ml分装液体时，不能很好地控制流量，每管不一定均为标准3ml。 2.3结论
VD =5.4ml VD总 =103.6ml。