根据示踪氨基酸的性质，终端产物法分为非必需氨基酸示踪法和必需氨基酸示踪法。非必需氨基酸示踪法是向体内注入某种15N标记的非必需氨基酸，通常用15N—甘氨酸。由于转氨基作用，由此引入体内的15N对其它氨基酸进行了标记，从而对体液氨基酸的代谢进行示踪，以由尿排除的尿素或氨N作为测定氨基酸分解速度的终产物。必需氨基酸示踪法是向体内引入某种标记的必需氨基酸，标记原子可以是C或N，但必需能够反映该必需氨基酸的代谢情况，用于测定氨基酸分解速度的终产物是标记CO2或尿素（氨N）。 1.1 15N—甘氨酸连续注入方法（终端产物法）：
该方法由Picou和Taylor Roberts于1969年提出，测定条件是同位素平衡和恒态代谢，测定指标是氨基酸的吸收速度和尿中排除尿素（或氨N）的速度及富集度（15N/N）。
（1）原理：该方法的原理见图9—7。
C 体液氨基酸 E 体蛋白 N 由尿排出的氨基酸N 消化道吸收I S
15
15N—甘氨酸F 图9－7 连续注入N－甘氨酸活体测定蛋白质的合成与分解速度原理
图中C为蛋白质的合成速度(mgN/h)；S为蛋白质的合成速度(mgN/h)；E为由尿排出氨基酸N的速度(mgN/h)，由测定平均每天由尿排出的尿素及氨N数量除24小时得出；I为由消化道吸收氨基酸N的速度(mgN/h)，由每天平均吸收量除24小时得出；F为N－甘氨酸N的注入速度(mgN/h)，为已知量。试验条件是恒态代谢，即测定过程中图中的各速度不变，一般可通过连续饲喂和减少环境刺激使动物接近恒态代谢。
15
恒态代谢时，体液氨基酸N的室容量不变，即有：
C＋I＝S＋E＝Q??? (1) 其中Q为蛋白质的周转速度。
连续注入15N—甘氨酸达到同位素平衡后，体液氨基酸N的15N/N比与由尿排出氨基酸N的15N/N比相等，因此可以通过测定尿中尿素或氨N的15N/N比得出体液氨基酸N的15N/N。令R＝15N/N，达到同位素平衡后，15N的注入量等于排出量，即有：
F＝(S＋E)R，即：
Q＝S＋E＝C＋I =F/R，室中E、F、R、I均为已知或可测量，因此蛋白质的合成和分解速度可由下式求出：
S＝F/R－E??? (2) C＝F/R－I??? (3)
上式的单位为mgN/h，若要转换为蛋白质的mg数，将上式计算结果乘以6.25即可。
（2）方法的假设：在以上推导过程中，暗含以下假设，这些假设与实际情况不完全相符，影响了测定的准确性。
a、严格的恒态代谢，测定过程中体液氨基酸N的室容量不变； b、合成到体蛋白的15N不再分解成氨基酸重新回到体液氨基酸室中； c、同位素的化学性质完全相同；
d、吸收的氨基酸与蛋白质分解产生的氨基酸在代谢上没有差别； e、15N—甘氨酸是有效的示踪物。
试验持续的时间越长，维持恒态代谢的难度越大，室容量有可能发生较大变化。同时随连续注入的延长，再循环15N对结果的影响增加。注入15N—甘氨酸，达到同位素平衡约需30—40小时，缩短平衡时间需要对体液氨基酸和尿素室进行启动注入。N—甘氨酸的注入速度为0.2μmol/kg/min.时，启动注入12μmol/kg的15N—甘氨酸可使体液氨基酸室达到平衡。目前生产的15N标记尿素的两个N原子均被标记，而注入15N—甘氨酸后体内合成的标记尿素只有一个N原子被标记，因此缺少直接启动注入尿素室的标记物。替代的方法是用
15
15
N—甘氨酸
进行间接启动注入，此时15N—甘氨酸的启动计量需达到720μmol/kg，虽可有效地缩短尿素室达到同位素平衡需要的时间，但使用剂量大大超出示踪剂量，注入
的15N—甘氨酸可能影响体液氨基酸的恒态代谢。另外的方法是测定由尿排除氨N的15N/N比，由于氨N的室容量小且周转速度快，达到同位素平衡所需时间少，不需要启动注入。但尿中的氨N主要来自谷氨酰胺的酰胺N，作为反映体液氨基酸N同位素富集度的终端产物不理想。 1.2 标记必需氨基酸连续注入方法：
可利用的标记氨基酸有多种。一些氨基酸在分解代谢过程中产生唯一来源的酮酸，可通过测定这些酮酸的富集度反映细胞内（直接用于蛋白质合成）该氨基酸的富集度，这类必需氨基酸有亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等。另一些必需氨基酸不产生唯一来源的酮酸，只能由血浆中该氨基酸的富集度反映细胞内该氨基酸的富集度。与非必需氨基酸不同的是，必需氨基酸的标记原子必须不能转移到其它氨基酸分子上，具有唯一性。符合这一条件的C、N原子均可。对C原子进行标记时，测定的终产物是CO2，对N原子标记时，测定的终产物是尿素或氨N。 (1) 13C—亮氨酸连续注入：该方法的测定原理见图9－8。
细胞内 血浆
蛋白质 I F 1313C—亮氨酸 C—亮氨酸 E * C S 13 CO2 α－异己酮酸（*KIC） *异戊酰辅酶A KIC
图9－8 连续注入C－亮氨酸测定蛋白质的合成和分解
测定条件为恒态代谢和同位素平衡。图中I为亮氨酸吸收速度，F为C－亮氨酸注入速度，
C为蛋白质分解速度，S为蛋白质合成速度，E为亮氨酸分解速度
13
13
亮氨酸来自吸收和蛋白质的分解，其代谢途径或者用于蛋白质合成，或者氧化分解。亮氨酸分解的第一步是脱氨基产生α－异己酮酸（KIC），亮氨酸脱氨是KIC的唯一来源，因此达到同位素平衡后KIC的富集度即是细胞内亮氨酸的富集度。假设血浆和细胞内亮氨酸的富集度相同，按（2）、（3）式可以计算出蛋白质
的合成和分解速度，此时E由收集呼出的CO2，测定单位时间13CO2的排出数量得出。以蛋白质的数量表示合成与分解速度，计算公式改为：
S＝(F/R－E)/590??? (4) C＝(F/R－I)/590??? (5)
其中S、C 的单位是g蛋白质/h，F、E、I的单位是μmol亮氨酸/h，每g蛋白质中平均含有590μmol亮氨酸。
亮氨酸的分解速度E由下式计算：
E（μmol/h）=RaC（μmol/h）×RC/Rleu??? (6)
其中RaC是二氧化碳的产生速度，RC是二氧化碳的同位素富集度，Rleu是亮氨酸的同位素富集度。
该方法的主要问题是：血浆和细胞内亮氨酸的富集度并不相同，由于亮氨酸是在细胞内代谢的，用细胞内亮氨酸的富集度优于用血浆内亮氨酸的富集度。KIC的唯一来源是亮氨酸的分解代谢，应能反映细胞内亮氨酸的富集度，且KIC可由细胞内排出到血浆内，是可测的。但有研究表明血浆KIC的富集度高于细胞内亮氨酸的富集度。另一个问题是吸收的亮氨酸在肝脏中被代谢，未能与注入的－亮氨酸混合，实际的I值小于由亮氨酸吸收测出的I值。
(2) 连续注入α－15N－赖氨酸或1－13C－赖氨酸：赖氨酸的α氨基极少发生氨基酸间的转氨基作用，而其1位碳原子一旦丢失，剩余残基也不能在合成赖氨酸，因此标记α氨基N或1位碳原子可以示踪赖氨酸的代谢。赖氨酸的分解代谢不产生唯一来源的中间产物，因此只能用血浆赖氨酸的富集度用于计算。计算公式为：
S＝(F/R－E)/544??? (7) C＝(F/R－I)/544??? (8)
13
13
C
C标记赖氨酸时E的计算公式为：
E（μmol/h）=RaC（μmol/h）×RC/Rly??? (9)
15
N标记赖氨酸时E的计算公式为：
E（μmol/h）=Raurea（μmol/h）×2μmol N/μmol 尿素×Rurea/Rly??? (10) 其中RaC是二氧化碳的产生速度，RC是二氧化碳的同位素富集度，Rly是赖氨酸的同位素富集度，Raurea是尿素的产生速度，Raurea是尿素的同位素富集度。 ⒉ 前体底物法
前体底物法是通过测定蛋白质合成前体—氨基酸合成到蛋白质中的速度，测定蛋白质的合成速度。根据标记氨基酸的注入数量和方法，又分为启动-连续注入法和大剂量法（Flooding dose）。 2.1启动-连续注入法：
注入启动剂量的标记氨基酸，使蛋白质合成前体氨基酸室迅速达到同位素平衡，通过连续注入维持平衡状态。蛋白质合成比速度FSR按下式计算：
FSR??Ebt?Eb0?/Ep?t?t0???? (11)
其中Ebt为开始注入标记氨基酸后时刻t的蛋白质中标记氨基酸的同位素富集度，Eb0为蛋白质中标记氨基酸的背景富集度，Ep为蛋白质合成前体标记氨基酸室的平衡同位素富集度，(t—t0)为从开始注入标记氨基酸到采集组织蛋白样品的时间间隔。
（11）式的推导过程假定在试验期间合成到蛋白质中的标记氨基酸未从蛋白质分子上解离下来，并且前体氨基酸的同位素平衡是即时达到的。设蛋白质中标记氨基酸的比例为P，蛋白质的总量为M，蛋白质合成比速度为FSR，则同位素标记氨基酸合成到蛋白质中的速度为Ep?FSR?M?P，经过t时刻后蛋白质中标记氨基酸的同位素富集度增加量为：
?Ebt?Eb0??Ep?FSR?M?P?t?t0?/M?P，整理后即得（11）式。
可选择血浆、组织液或氨基酸—tRNA中的标记氨基酸作为前体氨基酸室。以氨基酸—tRNA最为合理，但测定难度较大，因此一般选择血浆或组织液中的标记氨基酸作为前体氨基酸。有试验结果表明，血浆氨基酸的平衡富集度高于组织液中的富集度，而tRNA中的富集度介于两者之间。以血浆氨基酸作为前体时，可在开始注入标记氨基酸后的不同时刻点采集血浆样品，测定富集度-时间曲线下的面积作为（11）式的分母，此时（11）式应写为：
tFSR??Ebt?Eb0?/?0Ep?t?dt??? (12)
以组织液或AA—tRNA作为前体氨基酸室需要采集组织样品，匀浆后离心分离组织液。多数情况下不能对组织连续活体采样，只能屠宰后采样，FSR的计算按（11）式。
以血浆氨基酸作为前体氨基酸室的优点是可以连续采样，即使不能迅速达到