同位素平衡 (12)式仍然是有效的。由于蛋白质合成是在细胞内进行的，因此细胞内的氨基酸是蛋白质合成的真正前体。一些氨基酸代谢过程产生特有的代谢物，其同位素富集度应与细胞内氨基酸的同位素富集度相同。对于这些氨基酸，可以通过采集血浆样品，测定其代谢物的同位素富集度，实现对细胞内氨基酸富集度在不同时刻点的测定。属于这类情况的氨基酸有：
（1）甘氨酸：安息香酸（benzoic acid）在肝脏中与甘氨酸结合形成马尿酸（hippuric acid），因此可以用马尿酸的同位素富集度作为肝脏中作为蛋白质合成前体的甘氨酸的富集度。
（2）亮氨酸：亮氨酸脱氨基产生α－异己酮酸（KIC），因此可用KIC的富集度作为细胞内亮氨酸的富集度。但血浆中的KIC来自不同的组织，而不同组织中作为蛋白质合成前体的亮氨酸的富集度是不同的。并且有研究表明血浆KIC的富集度高于细胞内亮氨酸的富集度。
（3）精氨酸：由尿素合成途径，瓜氨酸既是精氨酸合成的前体，也是尿素的合成前体，因此尿素C原子的富集度（标记C可由H14CO3引入）或尿素N原子的富集度（标记N原子由15NH3或15N－甘氨酸引入）反映了蛋白质合成前体精氨酸的富集度。
2.2 大剂量注入：
由于启动-连续注入方法在确定蛋白质合成前体氨基酸富集度方面的困难，因此提出了大剂量注入方法。该方法的原理是一次注入大剂量的标记和非标记氨基酸，以至大大超出体内游离氨基酸的总量，使各处氨基酸的富集度相等。注入氨基酸的总量一般超出体内游离氨基酸总量的11倍。如绵羊体内游离苯丙氨酸的浓度约为0.0479mmol/kg体重，标记和非标记苯丙氨酸的注入量应超过0.55mmol/kg活重。试验时，注入标记和非标记氨基酸后，间隔5min。采集血样，共采4－5个样品。之后迅速屠宰动物，采集不同组织的样品迅速在液氮中冷冻，完成注入至采集完最后一个组织样品间的时间间隔越短越好，一般不超过1小时。测定血浆和组织蛋白中的苯丙氨酸富集度，按（11）或（12）式计算FSR。 ⒊ 动静脉差法：
对于有独立的回流静脉并可在回流静脉上安装血管插管的组织器官（如门静脉回流内脏组织、后肢肌肉组织等），可以测定流经该组织器官的血流量和进出
组织器官的氨基酸数量，通过测定进出的标记和非标记氨基酸数量可估测该组织器官的蛋白质合成与分解速度。
设组织器官的血流量为F，动脉中某氨基酸的浓度为CA，静脉中的浓度为CV。经启动和连续注入同位素标记的该氨基酸，血样中的氨基酸迅速达到同位素平衡，只要注入标记氨基酸至采样时间足够短，合成到组织蛋白中的标记氨基酸极少解离下来，可以认为静脉中少于动脉的标记氨基酸被用于了组织蛋白的合成。设动脉中氨基酸的同位素富集度为EA，静脉中的富集度为EV，组织液中的富集度为EM。
氨基酸的动静脉差为： AAT＝（CA－CV）F
同位素标记氨基酸的动静脉差为： AAB＝（CAEA－CVEV）F
氨基酸合成到组织蛋白质中的速度为：
U?AAB/EM??CAEA?CVEV?F/EM?????(13)
氨基酸的动静脉差应为组织中氨基酸合成到蛋白质中的速度U与由蛋白质解离下来的速度P之差，亦即AAT＝U－P，因此氨基酸由蛋白质中解离下来的速度为：
P?U?AAT?AAB/EM??CA?CV?F
??CAEA?CVEV?FB/EM??CA?CV?F??? (14)
其中CA、CV、EA、EV可由采得的动静脉血样测定，F可由上下游稀释或电磁血流量计测定，EM可由采得的组织样品测定。在已知某氨基酸在组织蛋白中的含量时，可将U、P换算为蛋白质合成和分解的速度。
动静脉差法的主要问题是，有时动静脉中氨基酸流量的差别很小，甚至在误差范围之内，而且U实际上包括合成到蛋白质中的氨基酸和被氧化分解的氨基酸，若能同时测定氨基酸的氧化产物，则可以得到用于合成到蛋白质中的氨基酸数量。另外对是否有从蛋白质上解离下来的标记氨基酸及其对结果的影响程度不清楚。
⒋ 肌肉蛋白分解速度的活体测定
3－甲基组氨酸（3－MeH）肌原纤维中肌动蛋白、肌球蛋白的部分组胺酸甲酰化的产物。3－MeH不能与tRNA结合，因此不会再合成到蛋白质分子上去。合成之后3－MeH大约有5％转变为N－乙酰－3－MeH，不再发生其它代谢，并全部由尿排出。产生的3－MeH大约91％来自骨骼肌，3.1％来自消化道蛋白，3.3％来自皮肤和结缔组织蛋白。测定由尿排出的3－MeH数量，按下式计算肌肉蛋白的分解速度：
B（mg蛋白/kg体重/天）＝每天、每kg体组织排出的3－MeH(μmole)/3.63 其中3.63是肌肉蛋白中3－MeH的浓度。 二. 测定能量代谢的双标记水方法
通过注入分别对氧或氢原子进行标记的同位素标记水分子测定体内氧化代谢的CO2产量的方法由Lifson于1975年提出。该方法为在正常生活状态下动物能量代谢的研究提供了可能。 ⒈ 基本原理
存在于体内多种组织、尤其是红细胞中的碳酸脱水酶（carbonic anhydrase）催化二氧化碳与水的结合，使二氧化碳与水分子结合的速度高于无催化结合13000倍。该酶的存在加快了二氧化碳与水分子间氧原子的交换，使体内CO2和H2O的氧原子之间可以很快地达到同位素平衡。向体内注入标记氧原子的水分子（如H218O）时，标记氧原子随排出体外的水和二氧化碳排出；而向体内注入标记氢原子的水（如2H2O）时，标记氢原子只随水排出。由注入两种不同标记水测定的水的周转速度差别可以测定出二氧化碳的产生速度。
双标记水方法操作简单、对动物无损伤。该方法只需通过口服给动物注入同位素标记的水，并准确称量动物的体重和每天（或数天）采集一次分析样品。采集的样品可以是血液、尿或唾液。 ⒉ 标记水的注入剂量 2.1 H218O的注入剂量：
H218O的价格较高，应基于减少试验费用和取得有效的试验数据确定H218O的注入剂量。一般最后一次采样距注入标记水的时间应为1.5－2个体内水的半滞留期，且最后样品的原子百分超（AP）应为尿样背景AP的100倍。水的半滞留期可由每天的排尿量和体内水分含量及体重估计，若体重为W、水分约占体重的
60％、每天排尿量为M，则估计的半滞留期为0.6W/2M。
注入H218O后，时刻t采得样品中H218O的浓度可由一室模型计算，即： C（t）＝C（0）e－kt
其中C（t）为时刻t样品中H218O的浓度（亦即18O的富集度），C（0）为注入H218O后水中18O的初始浓度。若H218O的注入剂量为Z0，则C（0）可由Z0/0.6W估计。k值则可由每天排尿量除以体内水分总量，即M/0.6W估计。由C（t）=0.25C(0)估计出最后一次采样的时间，最后一次尿样的富集度一般应高于0.0001gH218O/gH2O。若水在体内的半滞留期为7天，两个半滞留期为14天；k为0.09，H218O的注入剂量估计如下： C（t）＝C（0）e－kt C（0）＝C（t）ekt
C?O??0.0001?e0.09?14?0.000352gH218O/gH2O
注入剂量＝0.000352×0.6×1000＝0.2112g H218O/kg体重 2.2 2H2O的注入剂量：
2
H2O的价格较低，可适当加大用量。用IRMS分析样品富集度时，注入剂量
应在0.3g/kg体重以上；而用红外分光光度法测定富集度时，因其灵敏度较低，注入剂量应达到0.9g/kg以上。 ⒊ 试验方法
唾液、尿及血液均可作为分析样品，但唾液样品中存在2H的轻微分馏现象，因此以采集尿或血液样品较好。同位素标记水可通过口服注入，尤其是单胃动物。反刍动物瘤胃中有大量的水，因此对反刍动物以静脉注入较好。
在Haggarty等以马鹿为试验动物的研究中，动物的平均体重为103±2kg，H218O的注入剂量为0.12g/kg体重，2H2O的注入剂量为0.16g/kg体重。标记水制成生理盐水，通过颈静脉插管注入，体积约60ml。动物饲养在围栏草地内，5只注入标记水，2只作为对照以测定标记动物排出环境中的标记水被动物重新摄入的数量。在试验当天的10：00安装颈静脉插管，采集空白血样（10ml）后，注入标记水。在当天15：00由另一侧颈静脉真空采血管采集血样10ml，之后每天采一次血样。血样制成血清，血清用超滤膜过滤掉大分子后保存待测。 ⒋ 计算方法
4.1 计算方法推导的一般依据
将体内的水视为单室模型，水的排出速度rH2O是速度常数k与室容量的乘积。设水中2H2O的消失速度常数为kh，H218O的消失速度常数为ko，CO2的排出速度为rCO2。由于2H只随水排出体外，而18O随水和二氧化碳排出体外，因此有：
rH2O?khN
rH2O＋2rCO2＝koN 即：
rCO2??k0?kh?N/2 4.2 k值的计算
按照一室模型，标记水的富集度（以高于背景的标记水浓度表示）与时间t和速度常数k的关系为：
C(t)＝C(0)e-kt??? (15)，取对数得： lnC(t)= lnC(0)－kt??? (16)
对于任意两个时刻点t1、t2测得的C(ti)，有: k= [lnC(t1)－lnC(t2)]/(t2－t1)??? (17)
k值的计算方法相应有三种，一是测定标记水的富集度随时间变化曲线，按(15)式进行最小二乘数据拟和，二是按(16)式进行最小二乘数据拟和，三是测定两个时刻点的富集度，由（17）式计算。 4.3 方法的假设
(1) 体内的水可看作是一室模型，标记水在其中分布并由此排出； (2) 2H只以水的形式排出体外；
(3) 18O以水和和二氧化碳的形式排出体外，并且水和二氧化碳间的碳原子交换相当迅速；
(4)水和二氧化碳的排出速度稳定；
(5)排出体外的水和二氧化碳与体内水的富集度相同（没有分馏现象）； (6)背景同位素摄入速度稳定。 4.4分馏现象
上述假设中，一般认为（5）是不成立的，分子量较大的水分子蒸发损失的速度较慢，而在水分子中的氧原子转移到二氧化碳分子上时，18O快于16O。因