江南大学硕士学位论文
抗氧化玉米肽的制备及其功能与结构关系的研究
姓名：代衍峰申请学位级别：硕士专业：食品科学指导教师：陈洁;熊幼翎
20080601
摘要摘要国内外研究表明，玉米醇溶蛋白水解物具有良好的抗氧化活性。本论文从玉米蛋白水解物的分子量、分子量分布和疏水性等性质出发，采用超滤、凝胶层析以及反相高效液相色谱等分离纯化手段制备抗氧化性玉米肽，并对分离产物采用ＤＰＰＨ自由基清除法、ＡＢＴＳ自由基清除法和超氧阴离子清除法进行抗氧化性实验，试图从多个角度探讨玉米蛋白水解物体系中的不同组分与其抗氧化能力的相关性。本课题研究不但对于阐明肽类抗氧化机理有重要意义，而且对于玉米蛋白的应用推广也有现实意义。论文首先研究了具有良好抗氧化性的玉米蛋白水解物的制备方法。结果显示，利用三氯甲烷对玉米蛋白水解物中脂质和黄色素等杂质脱除后，进一步采用Ｃ１８反相填料吸附色素，可以除掉玉米蛋白水解物中残存的黄色素，避免了黄色素对于玉米肽抗氧化性研究的干扰。本论文采用碱性蛋白酶Ａｌｃａｌａｓｅ，在ｐＨ９．０、５０。Ｃ下水解玉米蛋白（３０９／Ｌ）４ｈ时（水解度达２１．６％），水解物整体具有最好的抗氧化性，１０ｍｇ／ｍＬ浓度的水解物ＤＰＰＨ自由基清除率为３５．７％，ＡＢＴＳ自由基清除率为５８．Ｏ％，超氧阴离子清除率为１１．１％。经高效液相色谱测定水解物的分子量分布，结果表明玉米肽分子量主要集中在２００Ｄａ＇－－９００Ｄａ，此分子量区域的肽段占总量的９０％以上。接着，论文采用了超滤、凝胶层析和反相高效液相色谱等分离手段，对酶解４ｈ的玉米蛋白水解物进行分离，并采用ＤＰＰＨ自由基清除法、ＡＢＴＳ自由基清除法和超氧阴离子清除法从分子量、分子量分布和疏水性等角度探讨玉米蛋白水解物中各个组分抗氧化活性的相关性及其功能与结构的关系。结果显示：（１）玉米蛋白水解物的抗氧化活性与其分子量具有相关性。ＤＰＰＨ自由基淬灭能力与其分子量有显著相关性，在分子量５０００以下，随着分子量的上升而下降。ＡＢＴＳ自由基淬灭能力和超氧阴离子淬灭能力在分子量小于５０００时，清除率没有显著性差异，随着分子量的继续增大ＡＢＴＳ自由基淬灭能力减弱而超氧阴离子淬灭能力增强。（２）玉米蛋白水解物的抗氧化活性与其疏水性也具有相关性。水解物采用疏水色谱分离，随着洗脱液极性的下降，依次被洗脱出的各个组分的ＤＰＰＨ自由基淬灭能力和超氧阴离子淬灭能力增强，但ＡＢＴＳ自由基淬灭能力出现先上升后下降趋势。说明水解物中的极性较弱的肽组分ＤＰＰＨ自由基淬灭能力和超氧阴离子淬灭能力较强，但极性中等的肽组分的ＡＢＴＳ自由基淬灭能力较强。在上述玉米蛋白水解物经过超滤、凝胶过滤以及疏水色谱分离后，获得三个纯组分，各分离组分经ＷａｔｅｒｓＰｌａｔｆｏｒｍＺＭＤ４０００质谱仪分析和Ｂｉｏｌｙｎｘ软件处理，结合蛋白质ＳＷＩＳＳ．ＰＲＯＴ数据库中玉米蛋白序列获得了两个确定的抗氧化性玉米肽的结构，分别为Ｔｙｒ－Ａｌａ和Ｈｉｓ．Ｃｙｓ．Ｍｅｔ．Ｌｅｕ。关键词：玉米蛋白水解物，制备，结构与功能，抗氧化ＡｂｓｔｒａｃｔＡｂｓｔｒａｃｔＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｒｅｓｅａｒｃｈｅｓａｔｈｏｍｅａｎｄａｂｒｏａｄ，ｔｈｅｚｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｈａｓａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｂａｓｅｄｗｅｉｇｈｔ，ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆｏｎａｇｏｏｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｈｅｐｅｃｕｌｉａｒｉｔｉｅｓｏｆｃｏｒｎｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，ｓｕｃｈａｓｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｒｅｖｅｒｓｅｄ—ｐｈａｓｅｗｅｉｇｈｔ，ｐｏｌａｒｉｔｙｈｉ曲ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅａｎｄｌｉｑｕｉｄＳＯｏｎ，ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ｇｅｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＲＰ—ＨＰＬＣ）ｏｆｔｈｅｗｅｒｅｕｔｉｌｉｚｅｄｔＯｓｅｐａｒａｔｅｓｅｐａｒａｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅＡＢＴＳｒａｄｉｃａｌａｎｄｐｕｆｆｙｔｈｅｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＴｈｅｎｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＤＰＰＨｒａｄｉｃａｌ，ｒａｄｉｃａｌｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｄｃｏｒｎｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｖｉｅｗ．ＩｔｉＳｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅａｎｄｔｈｅｉｒａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｆｒｏｍｖａｒｉｏｕｓｐｏｉｎｔｓｏｆｗｅｌｌａｓｗｉｔｈｔｈｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｔｏｉｌｌｕｓｔｒａｔｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＣＯｒｎｐｅｐｔｉｄｅｓ．ａｓｐｒａｃｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｆｏｒｐｒｏｍｏｔｉｎｇｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｒｎｐｒｏｔｅｉｎｓ．ｎｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆｃｏｒｎｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，ｗｈｉｃｈｈａｄａｔａｇｏｏｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｆｉｒｓｔ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ＴｏｔｈｅＣＯｒｎｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，ａｆｔｅｒｔｈｅｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｙｅｌｌｏｗｐｉｇｍｅｎｔｉｎｌｉｐｉｄｓｂｙｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ，ｔｈｅｒｅｖｅｒｓｅｄ．ｐｈａｓｅｆｉｌｌｅｒ，Ｃ１８，ｗａｓｕｓｅｄｔｏａｂｓｏｒｂｔｈｅｒｅｓｉｄｕｅｓｏｆｙｅｌｌｏｗｏｎｐｉｇｍｅｎｔ．ｗｈｉｃｈａｖｏｉｄｅｄｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｏｆｙｅｌｌｏｗａｖｏｉｄｅｄｔｈｅｔｈｅＡｌｋａｌｉｎｅｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｏｆＣＯｒｎｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｔｈｉｓｐｒｏｃｅｓｓｐｉｇｍｅｎｔｐｉｇｍｅｎｔｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｔｈｅｎｏｎｐｒｏｔｅａｓｅａｌｃａｌａｓｅｗａｓｕｔｉｌｉｚｅｄｔｏｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ９．０ａｎｄ５０＂Ｃ．Ａｆｔｅｒ４ｈｏｕｒｓＣＯｒｎｐｒｏｔｅｉｎ（３０９／Ｌ）ｕｎｄｅｒｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｐＨｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｈａｄｔｈｅｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ（ｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆｓｔｒｏｎｇｅｓｔａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ＴｈａｔＷａｓｔｏＷａｓ２１．７％），ｔｈｅｓａｙ，ＤＰＰＨｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙＷａｓ３５．７％，ＡＢＴＳｒａｄｉｃａｌｗａｓ５８．０％，ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｒａｄｉｃａｌＷａｓ１１．１％．ＦｉｎａｌｌｙｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅＷａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｔｈｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｒａｎｇｅｐｅｐｔｉｄｅｓＷａｓＩｎｂｅｔｗｅｅｎ２００Ｄａ－－一９００Ｄａ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｃｏｒｎａｒｅａｏｆｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ９０％．ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｏｒｄｅｒｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｂｅｔｗｅｅｎｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｗｅｉｇｈｔａｎｄｔｈｅｉｒａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｆｒｏｍｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ，ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ，ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ｇｅｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅｌｉｑｕｉｄｈｉｇｈａｎｄｃｏｒｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）ｗｅｒｅｕｔｉｌｉｚｅｄｔｏｓｅｐａｒａｔｅａｎｄｐｕｆｆｙｔｈｅｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｔｈｅｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｔｈｅｉｒｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＤＰＰＨｒａｄｉｃａｌ，ＡＢＴＳｒａｄｉｃａｌａｎｉｏｎｒａｄｉｃａｌ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓａｆｏｌｌｏｗｓ：（１）Ｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｈａｄａｃｔｉｖｉｔｙｈａｄａｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｔｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｔｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｉｋｉｎｇｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｗｅｉｇｈｔ．ＤＰＰＨｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｗｅｉｇｈｔ．ＴｈａｔＷａｓ，ＤＰＰＨｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｇｒａｄｅｄａｓｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒＨｏｗｅｖｅｒ，ＡＢＴＳｒａｄｉｃａｌｏｂｖｉｏｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．Ａｓｗｅｉｇｈｔｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｅｌｏｗｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ５０００Ｄａ．ａｎｄｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｄｉｄｎ’ｔｓｈｏｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｉｎｃｒｅａｓｅｄｇｒａｄｕａｌｌｙ，ＡＢＴＳｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｇｒａｄｅｄｂｕｔｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｅｎｈａｎｃｅｄ．（２）ＴｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＣＯｒｎｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｈａｄａｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｔｓｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ．ＴｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅＷａｓｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ａｓｔｈｅｐｏｌａｒｉｔｙｏｆｄｅｇｒａｄｅｄ，ＤＰＰＨｒａｄｉｃａｌｅｌｕａｎｔａｎｄｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｇｒａｄｕａｌｌｙｅｌｕｔｅｄｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｅｎｈａｎｃｅｄｗｈｉｌｅＡＢＴＳｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｅｄｆｉｒｓｔｌｙａｎｄｌＩＡｂｓｔｒａｃｔｄｅｇｒａｄｅｄｌａｔｅｒ，ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅｌｏｗｅｒｐｏｌａｒｉｔｙｐｅｐｔｉｄｅｓｈａｄｔｈｅｓｔｒｏｎｇｅｒＤＰＰＨｒａｄｉｃａｌａｎｄｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｍｉｄｄｌｅｐｏｌａｒｉｔｙｐｅｐｔｉｄｅｓｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｒＡＢＴＳｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｆｔｅｒｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ｇｅｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｕｌｄｂｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅｙｗｅｒｅａｓａｂｏｖｅｍｅｎｔｉｏｎｅｄ，ｔｈｒｅｅｐｕｒｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＷａｔｅｒＰｌａｔｆｏｎＩｌＺＭＤ４０００）ａｎｄＢｉｏｌｙｎｘＳｏｆｔｗａｒｅ．ＴｈｅｒｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｃｏｍｐｅｐｆｉｄｅｓＷａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｈｅｈｅｌｐｏｆｔｈｅＳＷＩＳＳ—ＰＲＯＴｄａｔａｂａｓｅ．ＴｈｅｙｗｅｒｅＴｙｒ－ＡｌａａｎｄｗｅｒｅｔｗｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｚｅｉｎｉｎＨｉｓ—Ｃｙｓ．Ｍｅｔ．Ｌｅｕ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｏｒｎｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙＩＩＩ独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：蠲蠲瘫日期：２幽！笸，［．关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学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