抗氧化玉米肽的制备及其功能与结构关系的研究 - 图文(3)

江南大学硕士学位论文表１－１玉米醇溶蛋白氨基酸组成１５，３３，４３，４４ＪＴａｂｌｅｌ－Ｉｔｈｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｏｆｚｅｉｎ氨基酸类别醇溶蛋白醇溶蛋白醇溶蛋白醇溶蛋白４ｈ水解物氨基酸～一一（ｇ／ｌＯＯｇ）（ｇ／ｌＯＯｇ）（ｇ／ｌＯＯｇ）（ｇ／ｌＯＯｇ）（ｇ／ｌＯＯｇ）１．３本课题研究的内容和意义为全面了解玉米肽抗氧化的功能活性，本文从ＤＰＰＨ自由基淬灭能力、ＡＢＴＳ自由基淬灭能力和超氧阴离子淬灭能力出发，将玉米蛋白酶解物经过超滤、凝胶层析色谱、反相高效液相色谱分离制备，探讨了玉米肽分子量、分子量分布和极性强弱对玉米肽抗氧化活性的影响，并对强抗氧化活性玉米肽进行质谱分析进一步研究其结构与功能的关系。这一研究不仅有利于玉米蛋白的充分利用，而且对于探索抗氧化规律的共性也提供了理论依据。主要研究内容如下：（１）制备具有强抗氧化活性的玉米蛋白水解物，去除玉米水解物中色素等影响玉米肽抗氧化活性测定的杂质。６第一章绪论（２）玉米蛋白水解物组成与其抗氧化活性的相关性。从分子量、分子量分布、疏水性等多个角度探讨玉米蛋白水解物体系中的不同组分与其抗氧化能力的相关性。（３）玉米蛋白水解物分离以及结构解析，为抗氧化结构与功能关系的研究提供理论基础。７江南大学硕士学位论文第二章抗氧化性玉米蛋白肽的制备２．１引言’很多物质具有抗氧化能力，但抗氧化功能的本质因原料的不同而各有差异【５４１，例如多酚类抗氧化物质，如生育酚等，主要以淬灭自由基为主：而抗坏血酸类，则以螯合金属离子以及发挥还原性为主；１３－胡萝卜素类可能以清除单线态氧为主。在很多关于蛋白质水解物抗氧化能力研究的文献中，由于采用不同的制备方法和测定方法，抗氧化能力也显著不刚５５，５６，５７，５８】。本章以玉米蛋白为原料，以碱性蛋白酶Ａｌｃａｌａｓｅ为水解酶，采用ＤＰＰＨ自由基清除法、ＡＢＴＳ自由基清除法和超氧阴离子清除法等抗氧化性实验综合评定水解液的抗氧化活性，为制备具有较高抗氧化活性的玉米蛋白水解物奠定基础。２．２实验材料和方法２．２．１实验材料玉米醇溶蛋白粉（含量９２％）碱性蛋白酶Ａｌｃａｌａｓｅ（食品级，２．４ＡＵ／ｇ）二苯基．１一苦味肼基自由基（简称ＤＰＰＨ）ＡＢＴＳＳｅｐｈａｄｅｘＧ一１ＦｒｅｅｍａｎＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓＬＬＣＮｏｖｏｚｙｍｅｓＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａＩｎｃＳｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＩｎｃＳｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＩｎｃ５葡聚糖凝胶Ａｍｅｒｓｈａｍ公司进口分装自制超纯水牛血清白蛋白（ＢＲ）国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司均为分析纯三（羟甲基）氨基甲烷（ＢＲ）焦性没食子酸（ＡＲ）过硫酸钾（ＡＲ）乙二铵四乙酸（ＡＲ）其它试剂２．２．２实验仪器Ｐｅｌｌｉｃｏｎ．２超滤系统Ｓｕｐｅｒｐｕｒｅｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；ＷａｔｅｒＳｙｓｔｅｍ上海赛鸽电子科技有限公司美国ＶＡＲＩＡＮ公司Ｃａｒｙ．５０紫外探头型可见光谱仪ＵＶ－２８００Ｈ紫外可见分光光度计Ｒ－５０１Ｂ真空旋转蒸发装置ＤＥＬＴＡ．３２０酸度计ＡＬ．２０４电子天平ＰＬ一２００２电子天平尤尼柯仪器有限公司上海亚荣生化仪器厂梅特勒一托利多仪器仪器有限公司梅特勒一托利多仪器仪器有限公司梅特勒一托利多仪器仪器有限公司上海安亭科学仪器厂德国ＨＡＡＫＥ公司８ＴＤＬ一５．Ａ台式离心机ＤＣ１０一ｋ１０加热循环致冷器第二苹抗氧化性玉米蛋白的制各２．２．３玉米蛋白水解步骤参照Ｋｏｎｇ．Ｂ【５１、徐力酬、金英姿【５９１、郑喜群ｆ４３１和汪建斌【６０】等酶解工艺，在５０。Ｃ、ｐＨ９．０将３０９玉米蛋白制成均匀的３０９／Ｌ悬浊液后，加入酶／底物（Ｅ／Ｓ）＝２％（ｍ／ｍ）碱性蛋白酶Ａｌｃａｌａｓｅ，水解（保持ｐＨ９．Ｏ）一定时间后调ｐＨ７．０并迅速沸水灭酶１０ｍｉｎ，冷却后离心（５０００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ），取上清液即为玉米蛋白水解物。２．２．４玉米黄色素等杂质的脱除方法一：参阅Ｆ．Ｗ．Ｑｕａｃｈｅｎｂｕｓｈｔ３８１、卢艳杰【６１１和张秋荣【６２１等人的实验方法，通过测定上清液的透光率，以吸光值Ａ４４５表示相对脱色效果。在４０＂Ｃ下，首先对玉米醇溶蛋白粉用乙酸乙酯萃取色素等杂质，在超声的条件下对固液比为１：５（ｇ／ｍ１）的玉米醇溶蛋白萃取６０ｍｉｎ，然后取上层萃取液离心（５０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ）后测上清液的吸光值‰５。继续对萃取后的固形物用乙酸乙酯萃取色素等杂质，重复萃取六次后，用丙酮／石油醚＝３／７（Ｖ／Ｖ）代替乙酸乙酯进一步对玉米蛋白固形物除杂，重复萃取六次并测吸光值‰５。方法二：参阅ＫｏｎｇＢ．＆ＸｉｏｎｇＹＬ．【５】实验方法，对未经脱色处理的玉米醇溶蛋白水解，将等体积的水解物和三氯甲烷加入分液漏斗中，在不断放气的情况下剧烈振荡５ｍｉｎ充分萃取色素，静置１５ｍｉｎ后放掉下层三氯甲烷萃取液并加入相同体积的三氯甲烷重复萃取两次。方法三：将玉米肽经过Ｃ１８反相填料柱（①１０．０×６０．０ｃｍ）吸附黄色素，首先用六倍体积的超纯水洗脱反相填料并收集洗脱液，其次先后采用六倍体积的２０％、５０％和１００％甲醇溶液洗脱反相填料，分别收集脱液浓缩并冷冻干燥。洗脱条件为流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；柱温：２５℃。２．２．５可溶性蛋白的测定采用Ｆｏｌｉｎ．酚法［３２，３３］测定蛋白浓度，参照赵亚华‘６３】生物化学实验技术教程。（１）试剂的配置试剂甲：（Ａ）称取ｌＯｇＮａＣ０３，２９ＮａＯＨ和０．２５９酒石酸钾钠（ＫＮａｃ４Ｉ－１４０８－４Ｈ２０），溶解后用蒸馏水定溶至５００ｍＬ。（Ｂ）称取０．５９硫酸铜（ＣＵＳ０４＂５Ｈ２０）溶解后用蒸馏水定溶至１００ｍＬ。每次使用ｆｊ｛『将（Ａ）５０份与（Ｂ）１份混合，即为试剂甲，其有效期为１ｄ。试剂乙：在２Ｌ磨口回流瓶中，力ｎ，Ｎ．１００９钨酸钠（ＮａＷ０４?２Ｈ２０），２５９铝酸钠（Ｎａ２Ｍ００４?２Ｈ２０）和７００ｍＬ蒸馏水，再加入５０ｍＬ８５％的磷酸，１００ｍＬ浓盐酸，充分混合均匀，接上回流管，以小火回流１０ｈ。回流结束时，加入１５０９硫酸锂（Ｌｉ２Ｓ０４），５０ｍＬ蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾１５ｍｉｎ，以便驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾１５ｍｉｎ）。然后稀释到ｌＬ，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用时用标准ＮａＯＨ滴定，酚酞做指示剂，然后适当稀释，使最终的酸浓度为１ｍｏｌ／Ｌ左右。（２）标准曲线的制作，以牛血清白蛋白为标准蛋白。取两组共１６支大试管，分别加入０、０．２ｍＬ、０．３０．７ｍＬ、０．８ｍＬ、０．４ｍＬ、０．５ｍＬ、０．６ｍＬ、ｍＬ标准蛋白质溶液（浓度为２５０１．ｔｇ／ｍ１），用水补足到１．０ｍＬ，然后每支试江南大学硕士学位论文管加入５毫升试剂甲，在旋涡混合器上混合，于２５℃下放置１０分钟。再逐管加入０．５毫升试剂乙（Ｆ０１ｉｎ一酚试剂）立即混匀，３０ｍｉｎ后以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，在６５０ｎｍ下测吸光值（Ａ６５０）。以蛋白质的浓度为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。（３）水解物浓度的测定将样品稀释至１００ｍｇ／Ｌ左右，由Ａ６５０计算稀释样品浓度（Ｄ稀释样品）。Ｄ样品＝Ｄ稀释样品×稀释倍数Ｎ２．２．６水解度的测定采用ｐＨ．Ｓｔａｔ滴定法［６４，６５】。根据多肽在不同ｐＨ的条件下解离状态不同：当ｐＨ值恒定时酶水解蛋白后形成的自由羧基、自由氨基或氨基酸残基数目不等；当在碱性条件下水解时，释放的氨基酸使溶液ｐＨ值明显下降，用稀碱液将其滴定回起始ｐＨ值，可以知道蛋白质的肽键断裂的情况，根据消耗的碱量计算水解度ＤＨ值。水解度＝（水解的肽键数／总肽键数）ｘ１００％计算公式：ＤＨ＝ＶＮａＯＨ?ＮＮ．ｏ．／（ａ?Ｍｐ?Ｈｔｏｔ）公式中：ＶＮａｏＨ：滴定消耗的碱体积（ｍＬ）ＮＮａＯＨ：滴定消耗的碱当量浓度（ｍｏｌ／Ｌ）Ｍｐ：参加蛋白水解的蛋白总量（ｇ）×１００％２－２２．１Ｈｔｏｔ：每克蛋白中肽键的克当量数（９．２ｍｍｏｌ／ｇ）０【：Ｑ．氨基酸的平均解离度（５０℃时，ｐＫ＝７．１＋０．０９）０【＿－－－－－１０ＰＨ－ｐＫ／（１＋１０ｐＨ。ＰＫ）ｐＫ＝７．８＋２４００木（２９８－Ｔ）／２９８ＴＴ＝２７３．１５＋ｔｔ：反应环境的温度（℃）ｐＨ：反应起ｐＨ值２．２．７抗氧化活性的测定方法２．２．７．１ＤＰＰＨ自由基清除法参考Ｂｒａｎｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ【６６】等发表的文献。其主要原理是：ＤＰＰＨ（２，２一Ｄｉｐｈｅｎｙｌ一１－ｐｉｃｒｙ?ｌｈｙｄｒａｚｙｌ）在有机溶剂（乙醇）中是一种深紫色稳定自由基，孤对电子在５１７ｎｍ有强吸收；随着ＤＰＰＨ与抗氧化剂释放的氢相结合，体系颜色由紫色变为淡黄，反应结束后达到稳定ＤＰＰＨ．Ｈ，剩余百分率与抗氧化剂的淬灭能力相对应。试剂配置：用无水乙醇溶解９．８５８ｍｇＤＰＰＨ并定溶至２５ｍＬ棕色容量瓶中，配成ｌｍｍｏｌ／Ｌ的溶液，冷藏放置，用时用无水乙醇稀释１０倍成０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的溶液。ＤＰＰＨ自由基清除法的步骤如表２．１所示。１０