抗氧化玉米肽的制备及其功能与结构关系的研究 - 图文(7)

江南大学硕士学位论文０．３Ｏ．２７０．２４褂毯蜒蝴姐皿∽＿卜∞卸Ｏ．０９０．０６Ｏ．０３ｌｉ口．Ｕ１。口．』甲Ｉｉ｛：盯－ｉ｛Ｊ＿‘＿ｎ’—ｍ０刷－Ｉ?上＿上‘肌Ｅ１１ｌ．口．！．｛．反相色谱各洗脱组分图３．７反相ＨＰＬＣ分离组分的ＡＢＴＳ自由基清淬灭能力Ｆｉｇ３－７ＴｈｅＡＢＴＳｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｅｐａｒａｔｅｄｗｉｔｈＲＰ－ＨＰＬＣ分子量小于１０００玉米蛋白水解物超滤组分采用Ｈｅｄｅｒａ高，意味着洗脱组分的极性越来越小。ＯＤＳ．２Ｃ１８柱分离时，采用甲醇梯度洗脱，随着洗脱时间的增加，洗脱溶剂中水的比例越来越少甲醇的比例越来越图３．５、３－６和３．７结果显示，在洗脱时间为５５ｍｉｎ后ＤＰＰＨ自由基淬灭能力和超氧阴离子淬灭能力普遍较强；极性最弱的２３号不但有最高的超氧阴离子清除率１００％，而且有最高的ＤＰＰＨ自由基清除率，比同浓度抗坏血酸（１０肛ｇ／ｍＬ）清除率（７６．１％）低。与ＤＰＰＨ自由基淬灭能力和超氧阴离子淬灭能力相比，ＡＢＴＳ自由基淬灭能力最强的组分出现极性较强部分，８号组分虽然ＤＰＰＨ自由基淬灭能力和超氧阴离子淬灭能力都比较低，但是拥有最强的ＡＢＴＳ自由基淬灭能力，其清除率比同浓度抗坏血酸（１０“ｇ／ｍＬ）的清除率（５４．５％）低。不同极性的抗氧化肽有不同的抗氧化能力，极性与抗氧化能力之间具有相关性。对于同一组分（如８号），它的三种抗氧化性并不一致，说明同一极性的肽的抗氧化机制并不一定相同。很多情况下肽的抗氧化能力要针对具体的抗氧化性检测方法，因此，使用不同机理的抗氧化检测手段具有重要的意义。抗氧化肽对于ＤＰＰＨ自由基的淬灭能力可以很好表达它对油溶性自由基的淬灭能力，对于ＡＢＴＳ自由基的淬灭能力可以很好表达它对水溶性自由基的淬灭能力，对于超氧阴离子的淬灭能力可以很好表达它催化０２‘与旷结合生成０２和Ｈ２０２的能力。第三章玉米肽的分离纯化及其制备ｌ０．９０．８０．７Ｏ．６僻毯０?５蜒０．４０．３０．２Ｏ．１０４ｈ水解物４１１水解物８号组分２３号组分抗坏血酸乍ｒ∥Ｌ车ｂ’１１Ｊ１列以Ｒ各抗氧化物质口ＤＰＰＨ自由基清除率口超氧阴离子清除率ａＡＢＴＳ自由基清除率图３—８各抗氧化物质的抗氧化活性Ｆｉ９３－８ｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓａｍｐｌｅｓ４’’由图３．８显示，玉米蛋白水解物的抗氧化活性是各个组分抗氧化活性的综合，整体抗氧化性比抗坏血酸低很多。对玉米蛋白水解物经过超滤、反相高效色谱分离纯化后，具有强抗氧化活性的玉米肽被分离出来，如８号组分（见图３．４）的ＡＢＴＳ自由基清除率接近同浓度抗坏血酸的ＡＢＴＳ自由基清除率；２３号组分（见图３．４）超氧阴离子淬灭能力超过了同浓度下抗坏血酸的超氧阴离子淬灭能力。３．４本辛小结本章采用了超滤、凝胶层析和反相高效液相色谱等方法，对玉米蛋白水解物进行分离并采用ＤＰＰＨ自由基清除率、ＡＢＴＳ自由基清除率方法和超氧阴离子清除能力三种方法从分子量、分子量分布及其极性等多个角度探讨玉米蛋白水解物中各个组分抗氧化活性的与其组成和结构的相关性。结果显示：（１）玉米蛋白水解物的抗氧化活性与其分子量具有相关性。ＤＰＰＨ自由基清除能力与其分子量有显著相关性，在分子量５０００以下，随着分子量的上升而下降。ＡＢＴＳ自由基清除能力和超氧阴离子清除能力在分子量小于５０００时，清除率没有显著性差异，随着分子量的继续增大ＡＢＴＳ自由基清除能力减弱而超氧阴离子清除能力变强。（２）玉米蛋白水解物的抗氧化活性与其疏水性也具有相关性。水解物利用疏水色谱在分离过程中，随着洗脱液极性的下降，各个组分的ＤＰＰＨ自由基淬灭能力和超氧阴离子淬灭能力增强，但ＡＢＴＳ自由基淬灭能力出现先上升后下降趋势。说明水解物中的江南大学硕士学位论文极性较弱的肽组分其ＤＰＰＨ自由基淬灭能力和超氧阴离子淬灭能力较强，但极性中等的肽组分的ＡＢＴＳ自由基淬灭能力比较强。２８第四章抗氧化短肽的特性分析第四章玉米抗氧化肽的结构解析４．１引言玉米蛋白水解液经过超滤、凝胶过滤分离以及反相色谱分离后，获得了多个不同抗氧化特征的肽链。本章采用液质联用对其结构特征进行进一步解析，试图为阐明玉米抗氧化肽的抗氧化结构提供数据基础。４．２实验材料和方法４．２．１实验材料甲醇（色谱纯）甲酸（分析纯）超纯水．江苏汉邦科技有限公司山东阿斯德化工有限公司自制４．２．２实验仪器液质联用仪Ｗａｔｅｒｓ高速离心机４．２．３实验方法４．２．３．１液质联用分析多肽结构采用ＷａｔｅｒｓＰｌａｔｆｏｒｍＺＭＤ４０００质谱仪（配Ｗａｔｅｒｓ２６９０色谱仪，Ｗａｔｅｒｓ９９６紫外检ＰｌａｔｆｏｒｍＺＭＤ４０００美国Ｗａｔｅｒｓ公司上海安亭科学仪器厂测器），将１０ｔｔＬ样品进样ＡｔｌａｎｔｉｓＣ１８（①２．１×１５０ｍｍ），利用电喷雾质谱解析软件（Ｍａｓｓｌｙｎｘ工作站中Ｂｉｏｌｙｎｘ软件）分析得氨基酸序列。色谱条件为流动相Ａ：水（Ｏ．１％甲酸）；流动相Ｂ：乙腈；梯度洗脱（５％Ｂ－－－，１００％Ｂ，１０ｍｉｎ）；离子方式：ＥＳＩ＋：毛细管电压：３．８８ＫＶ；锥孔电压：６０Ｖ；离子源温度：１００℃；脱溶剂气温度：２５０℃；质量范围：１５０－－－，１０００ｍ／ｚ；光电倍增器电压：７００Ｖ；真空度：２．６ｘ１０一Ｐａ；雾化气流量：４．２Ｌ／ｈ。４．２．３．２玉米蛋白氨基酸数据库确定多肽结构将液质联用分析得到的氨基酸序列在蛋白库ＳＷＩＳＳ．ＰＲＯＴ中检索玉米蛋白质序列。４．３结果与讨论将反相高效液相色谱中较强抗氧化的组分（图３—４中８号、１７号、１８号、２０号、２１号、２２号和２３号组分），采用Ｗａｔｅｒｓ软件分析，结果如图４．１一图４．８所示。ＰｌａｔｆｏｒｍＺＭＤ４０００质谱仪进行分析并由Ｂｉｏｌｙｎｘ（１）８号组分经ＬＣ／ＥＳＩ．ＭＳ分析和Ｂｉｏｌｙｎｘ软件处理，结果如图４．１所示。２９江南大学硕士学位论文０７１２２６．１０８．５７４：ＤｉｏｄｅＡｒｒａｙ２７５Ｒａｎｇｅ：２．?２．０ｅ．三１．０ｅ．１．３３．８．０５０．０７１２２６－１０八一ｒ５．００一—～＼Ｌ１０．００一一一一１５．００２０．００２５．００３０．００３：ＳｃａｎＥＳ－２５１７３ｅ６８．７０５．０００７１２２６．１０１Ｏ．００８．６６１５．００２０．００２５．００‘。３０．００２：ＳｃａｎＥＳ＋２５３１．２０ｅ４一零１＿９０２．９８一一一．５．００Ｌ１４１９．１１１３／．．１／８１．１９８２／．．７２一２８１８Ｔｉｍｅ３０．００１Ｏ．ｏｏ１５．００２０．００２５．００图４．１Ａ８号组分解析图谱Ｆｉ９４—１ＡＴｈｅａｎａｌｙｓｉｓＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆｔｈｅ８ｔｈｆｒａｃｔｉｏｎ如图４．１Ａ所示，８．５７ｍｉｎ洗脱峰在ＥＳ＋图谱中时荷质比（ｍ／ｚ）为２５３，在ＥＳ一图谱中ｒｎ／ｚ＝２５１，响应值都很高且单一。蜊２Ｌ吐Ａ，１ａ瓢＋Ａｌａ２：ＳｃａｎＥＳ＋３５ｅ４１∞１∞２∞２∞３００３５０４００４５０５００５５０６００６５０７００３０