抗氧化玉米肽的制备及其功能与结构关系的研究 - 图文(2)

墨二里堕丝弟一早硒形第一章绪论功能肽的生理活性主要表现在抗氧化、抗菌、抗肿瘤、防辐射、抗高血压、抗血栓、调节免疫力、促进矿物元素吸收、呈味、增强学习和记忆以及调节胃肠动力等等。现有的研究发现，很多不同来源的水解蛋白都具有一定的抗氧化能力，例如乳清蛋白【啦】、大豆蛋白【３一、玉米蛋白【５１、鱼皮胶原蛋白‘６１等等的水解物都具有一定的抗氧化活性。目前，关于抗氧化肽的制备及其功能与结构的关系成为功能活性肽研究的重要方向。玉米蛋白以其水难溶性以及赖氨酸、色氨酸的严重缺乏致使其利用率低，但是其高比例（见表１．１）的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸以及高含量支链氨基酸和中性氨基酸是植物蛋白中颇为少见的特色组成，正是这种不平衡的氨基酸组成使玉米蛋白成为功能活性肽的来源。玉米蛋白肽具有多种生理功能（除有显著的抗氧化能力【５】外，兼有降血压、提高免疫能力等功能），在众多功能活性肽的研究中倍受重视。ＢａｏｈｕａＫｏｎｇ和ＹｏｕｌｉｎｇＸｉｏｎｇｌ５ｊ（２００６年）对玉米蛋白酶解及其水解物在脂质体系中抗氧化能力进行了广泛的研究。目前，国内对玉米抗氧化肽的研究主要集中在利用单一酶或者复合酶水解来提高水解度和优化水解条件，以提高玉米蛋白的利用率或玉米肽的抗氧化活性。关于玉米蛋白水解物的组成和抗氧化功能相关性的研究很少。本论文研究玉米蛋白肽的组成与抗氧化活性关系，并试图分离纯化出具有高抗氧化活性的抗氧化肽，研究工作具有良好的学术意义，有助于探索蛋白质水解物的抗氧化共性规律，同时对抗氧化性玉米蛋白肽的应用也具有现实意义。本课题来源于十一五“８６３＂项目“抗氧化肽的生物制备技术＂（２００７ＡＡ】０２３２３）。１．１玉米肽概述１．１．１玉米蛋白肽的功能活性现有的研究发现，玉米短肽具有很多功能特性【７１，例如抗疲劳、抗高血压以及抗氧化功能等。这些功能性肽的功能特征，与其水解程度相关。例如（１）随着水解度的提高，可解离的基团（ＮＨ＋４，－－ＣＯＯ一）数目增多，促使亲水性及净电荷的增加，使其溶解度迅速增大，并成为可溶性肽，在较宽的ｐＨ值范围内仍可保持溶解状态，酸性条件下不易凝聚，等电点处不易沉淀悔】。（２）随着多肽链分子数的减少，玉米蛋白水解物的易吸收性，低过敏性及低抗原性提高【９】。（３）玉米肽对热很稳定，短时间加热活性变化不大【１０】；而且黏度随温度变化不大，即使在５０％的浓度下仍具有良好流动性【ｌｌ】。已经报道的玉米功能活性肽很多，包括高Ｆ值寡肽、醒酒肽、抗疲劳肽、降血压肽以及抗氧化肽等等。（１）高Ｆ值寡肽Ｓｈｉｎｙａ［１２】（１９９０年）等人用嗜菌蛋白酶和肌动蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白制取了无苦味的高Ｆ值寡肽，产率５６％，Ｆ值２０．ｏｏ，ＡＡＡ含量为１．８６％。谷文英【１３，１４１（２０００年）以玉米蛋白粉为原料制备了高Ｆ值寡肽，并对高Ｆ值寡肽防治肝性脑病进行动物实验，江南大学硕士学位论文已于２０００年８月通过了国家轻工业局组织的专家验收。郑喜群Ｉｌ５】（２００４年）重点考察了米曲霉固态发酵产生羧肽酶的影响因素，碱性蛋白酶和米曲霉羧肽酶两次酶解蛋白后的寡肽分子量分布，活性炭吸附去除寡肽中芳香族氨基酸的效果。王海波１１６Ｊ（２００６年）用木瓜蛋白酶水解制备玉米高Ｆ值寡肽，结果表明木瓜蛋白酶水解最佳水解条件：Ｅ／Ｓ＝４．５％、ｐＨ＝６．５、温度为４５℃、时间为４ｈ。（２）醒酒抗疲劳肽日本学者山口孙一【１７】（１９９２年）和佐野良史‘１７】（１９９３年）研究发现酶解得到的玉米肽具有消除疲劳、改善酒醉的功能。Ｙ．Ｎａｋ锄ｕｒａ【１８】等（１９９６年）报道了玉米肽除具有降血压的功能外还具有抑制乙醇中毒和抗机体疲劳的作用；李晶【ｌ９Ｊ（２００４年）通过对小鼠的游泳时间、血乳酸、血中尿素氨、肝糖原含量和肌糖原含量各指标的测定证明了玉米肽具有抗疲劳的作用。昌友权【２０】（２００４年）对玉米肽进行了抗疲劳作用的实验，结果表明玉米肽能增强小鼠游泳耐力、延长爬杆时间，降低血乳酸、血中尿素氮含量，提高肝糖原含量和肌糖原含量，玉米肽具有抗疲劳作用。李升福【２ｌ】（２００６年）在研究玉米水解最佳条件和性质的基础上，以小白鼠为试验对象，讨论玉米蛋白水解物的抗疲劳效果。王淑嫒【２２】（２００７年）采用中性蛋白酶在ｐＨ６．７～７，温度４５℃，改变酶底比、料液比和酶解时间的条件下，分别得到高中低不同水解度的肽；动物实验表明：喂食低水解度（ＤＨ＝９．１％）的肽能极显著抑制酒精灌胃小鼠血清中乙醇浓度的升高。（３）降血压肽日本学者Ｓ．ＭｉｙｏＳｈｉ［２３】（１９９６年）从玉米醇溶蛋酶解物中得到了Ｌｅｕ．Ｐｒｏ．Ｐｒｏ，这是迄今发现的最好的降血压肽（ＡＣＥ），效果与Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ相当；我国学者赵金兰【２４Ｊ（１９９８年）用嗜热菌蛋白酶水解玉米蛋白粉，获得了具有ＡＣＥ抑制活性的功能短肽。李世敏【２５Ｊ（２００６年）以玉米蛋白为原料酶解得到的酶解液具有降血压活性，为了得到高活性的降血压肽单体，采用了离子交换层析法、凝胶层析和ＲＰ．ＨＰＬＣ对酶解液进行了的分离纯化，并得到了五个降血压多肽单体。王进【２６】（２００７年）比较了高降血压活性大豆肽、玉米肽、复配肽ＡＣＥ的抑制活性，其抑制率分别为６３．０５％、８２．５９％、８４．０２％。复配肽不但ＡＣＥ抑制率最高，营养价值高，而且与玉米肽相比，水解时间可减少１４ｈ，节省能源。黄家音【２７】（２００７年）选用嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶等４种酶来水解玉米蛋白制备降血压肽，研究表明碱性蛋白酶的水解能力最强，碱性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶的水解产物都达到了很好的ＡＣＥ抑制活性（９０％左右）。（４）抗氧化肽徐力【２８】（２００２年）采用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．２５（①２ｘ６６ｃｍ）凝胶层析方法进行玉米黄粉的碱性蛋白酶水解产物分子量分布和抗氧化活性的测定，同时与ＳＯＤ活性进行比较，结果表明，链长为２－６个氨基酸残基的玉米肽具有较好的超氧化物歧化酶活性，并且用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．１０和Ｇ．１５凝胶层析、ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＣＧ．１２０（钠型，ｍ３．５ｘ４０ｃｍ）阳离子交换层析和反相色谱制备柱（Ｃ１８，西７．８ｘ３０ｃｍ）制备了具有高纯度的抗氧化肽，用质谱测其氨基酸序列为Ｌｅｕ．Ａｓｐ．Ｔｙｒ－Ｇｌｎ。李相鲁【２９】（２００２年）报道了玉米抗氧化肽的制备、结构表征和性质的研究，以玉２第一苹绪论米蛋白粉为原料，经酶解、分离、纯化、结构表征获得了具有抗氧化性肽。何慧【３０】（２００２年）等将大豆蛋白和玉米蛋白复配，用碱性蛋白酶酶解制备的水解物具有较好抗油脂氧化能力，水解时间是影响酶解物抗羟自由基活性的主要因素。ＢａｏｈｕａＫｏｎｇ和ＹｏｕｌｉｎｇＸｉｏｎｇ【５Ｊ（２００５年）利用蛋白酶水解玉米醇溶蛋白，结果表明在底物浓度为３％的玉米蛋白悬浮液体系中采用碱性蛋白酶Ａｌｃａｌａｓｅ的水解效果较好，并且４ｈ的水解物在脂质体系中的抗氧化效果最好。张强【３０ｊ（２００５年）用２７０９碱性蛋白酶水解玉米黄粉，将制得的玉米肽混合物进行体外抗氧化活性的研究，发现玉米肽对超氧阴离子自由基和羟自由基有强烈的清除作用，并能显著抑制红细胞和肝脏、心脏、脑组织脂质过氧化反应的发生。王晶【３ｌＪ（２００８年）采用碱性蛋白酶（Ａｌｃａｌａｓｅ）对玉米蛋白进行水解，研究表明采用底物浓度１０％，加酶量与底物蛋白比为１：１００，水解时间为５ｈ的水解物具有最强的抗氧化能力。朱艳华【３２】（２００８年）用Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６】测定了玉米多肽的还原力，采用脱氧核糖．铁体系、超氧阴离子自由基体系、二苯代苦味肼基自由基体系对玉米多肽的抗氧化活性进行了研究，并同抗坏血酸进行了比较；结果表明玉米多肽具有还原力，玉米多肽清除：ＤＰＰＨ?和０２’?的能力均低于抗坏血酸，玉米多肽５ｍｇ／ｍＬ时，ＤＰＰＨ?清除率接近５７．５９％，１０ｍｇ／ｍＬ时，０２－．清除率为４６．０５％。１．１．２玉米功能肽制备方法研究进展玉米功能肽的制备大多采用酶水解法制备。日本学者山口孙一【１７】（１９９２年）和佐野良史㈣（１９９３年）通过对玉米蛋白进行特。定的酶水解，除去游离氨基酸后制得的玉米肽分子量较小；粘度较小，即使在５０％的高浓度下，流动性也很好；透明性好，对热稳定，可溶性好等特点。王梅【３３Ｊ（１９９９年）等报道了酶解玉米黄粉制备可溶性肽的研究，所用酶为碱性蛋白酶，讨论了温度、ｐＨ、底物浓度、酶浓度及预处理对水解的影响。郑冬梅与孔保华【３４】（２００２年）对玉米蛋白的酶解方式、玉米肽的功能特性、生理活性及其苦味的去除进行了研究。并通过旋转回归设计证明【Ｅ】／［Ｓ】、ｐＨ、温度三因素是影响Ａｌｃａｌａｓｅ水解玉米蛋白质的主要因素，三个因素对蛋白回收率的贡献率为：【Ｅ］／［Ｓ】＞ｐＨ＞温度。韩继福【３５】（２００３年）等对玉米蛋白粉的最佳酶解条件进行了摸索，通过对正交试验数据的分析，结果表明对水解度影响最大的因素为酶浓度，其次是底物浓度和温度，ｐＨ值影响最小。ＹｏｕｌｉｎｇＸｉｏｎｇ［５】（２００６年）对玉米醇溶蛋白采用碱性蛋白酶Ａｌｃｆｌａｓｅ和中性蛋白酶Ｐａｐｍｎ的不同浓度进行水解，结果发现对３％的玉米蛋白悬浮物水解时［Ｅ］／［Ｓ］＿３％的Ａｌｃａｌａｓｅ有较好的水解效果。１．１．３玉米肽开发价值及应用前景近年来，功能活性肽已成为食品学界研究最为热门的课题之一。日本对肽的研究处江南大学硕士学位论文于领先地位，并以活性肽为功能因子开发出了多种低糖原食品、降压食品和醒酒食品等一系列产品，取得了良好的社会效益和经济效益【３６１。如以玉米蛋白为原料生产的玉米肽“Ｐｅｐｔｉｎｏ”作为保护肝脏、防止醉酒的饮料已经上市，还成功开发了成低热量早餐饮料ｆ３７，３８，３９１和具有降血压作用的玉米肽混合物“缩氨肽”等食品及医药品１１９１。而我国对活性肽的研究刚刚起步，研究力量及投入较少，虽然国内的一些公司也利用先进的技术开发出多种肽类产品，如中国已经开始使用糖肽辅助治疗肿瘤，但是市场上国产的活性肽药品和食品仅从产品的数量上来看，就不能满足人民的需要，玉米活性肽产品更是稀少。总体看来，我国玉米蛋白资源丰富，玉米蛋白粉价格低廉；玉米蛋白氨基酸组成ｐ副决定了适合药用肽的制备（降血压、高Ｆ值寡肽等）和功能食品（降胆固醇食品、非过敏食品等）及添加剂（食品、化妆品、饲料等），但是由于玉米蛋白水溶性差，且赖氨酸和色氨酸的缺乏（见表１．１），严重限制了它在食品工业中的应用，导致主要用作饲料，从而造成了资源极大的浪费。如果能把玉米蛋白进行酶解及深层次加工、改性，生产成附加值高的饮料、食品基料或药品基料，可有效提高蛋白的使用价值，有利于企业生产效益的提高［４０，４１，４２Ｊ。１．２抗氧化肽作用机理以及结构与功能关系的研究现状肽的组成不同抗氧化性不同，即使同一肽检测抗氧化的方法不同，其抗氧化性差别可能很大，主要的原因是肽的组成和结构不同导致抗氧化机理的不同。ＵｃｈｉｄａＫ【６】（１９９２年）等的研究报道认为含有组氨酸的肽一般具有抗氧化性，这归功于咪唑基的金属离子螯合能力和脂游离基淬灭能力。含有酪氨酸的肽也具有一定的抗氧化性，因为酪氨酸是一个潜在的氢供体。Ｈｕａ－ＭｉｎｇＣｈｅｎ［４５】（１９９６年）等认为大豆抗氧化肽可以在体外抑制被铁红蛋白、血红蛋白、脂质氧化酶和单线态氧催化的脂质氧化作用，这些肽还可以通过与ＰＰＯ催化的醌式产物反应，而减少食物褐变，防止聚合氧化产物的生成；在Ｎ端含有疏水性氨基酸缬氨酸或亮氨酸、分子链中含有脯氨酸、组氨酸、色氨酸或者酪氨酸，分子量在３．１６氨基酸的大豆蛋白水解物都具有抗氧化性。沈蓓廿【４６】（１９９６年）利用酸性蛋白酶ＡＰ在ｐＨ３．０、５０。Ｃ、酶／底物（Ｅ／Ｓ）＝２５０扯ｇ／ｇ的条件下酶解大豆分离蛋白得到了分子量约７００Ｄａ的抗氧化肽。Ｌｅｅ，Ｂ．ｊＥ４７】（１９９７年）等报道，肌肽可抑制金属离子催化核糖降解表明，肌肽可能具有清除引起脱氧核糖降解的?ＯＨ的能力或者与铜离子结合形成无催化活性的复合物，从而抑制铜离子的催化作用，或者是两种作用共同作用的结果。Ｋｏｈｅｎｍ】等报道肌肽可作为还原剂，其供给自由基捐献电子的能力与抗氧化能力相关；做为供氢体使肌红蛋白上的血红素保持二价，从而抑制了正铁肌红蛋白的形成。Ｈｕａ．ＭｉｎｇＣｈｅｎｌ４８】（１９９８年）等根据Ｌｅｕ．Ｌｅｕ．Ｐｒｏ．Ｐｒｏ—Ｈｉｓ．Ｈｉｓ（ＬＬＰＰＨＨ）设计了３２个新肽，其最长由６个氨基酸残基（ＬＬＰＰＨＨ）构成，最短由２个氨基酸（ＨＬ或ＨＨ或ＬＨ）构成，它们对诱导的亚油酸氧化、单线态氧、ＤＰＰＨ自由基、超氧阴离子自由基均有一定的抑制或淬灭能力，但在不同体系中不同的肽的这些能力有较大差异，它们４第一苹绪论抗氧化时与非肽类抗氧化剂显示出协同效应。刘大川与钟方划４９】（１９９８年）利用碱性蛋白酶２７０９在ｐｉｌｌ０．５、５５。Ｃ、Ｅ／Ｓ＝５％、Ｓ＝５％的条件下作用于大豆分离蛋白得到了分子量在１０００Ｄａ以下的抗氧化肽。王梅和戴军掺ｏ】（１９９８年）用高效凝胶过滤色谱法测定了玉米蛋白酶解产物寡肽的分子量分布，并研究了碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉的反应过程，得出了相应的动力学参数。张学忠【５ｌＪ（１９９９年）等利用一种底物专一性不太强的工业用蛋白酶，在５０。Ｃ条件下酶解脱脂豆粕２ｈ，获得了分子量分布在１００．１３００Ｄａ的抗氧化肽。ＳｕｅｔｓｕｎａＫ［５２１（２０００年）等用木瓜蛋白酶水解的酪蛋白水解物的抗氧化性来自于对自由基的淬灭能力，这些肽能够淬灭超氧阴离子，氢过氧化物以及ＤＰＰＨ自由基，而酪蛋白磷酸肽（ＣＰＰ）的抗氧化性来自于对金属离子的螯合能力；并且从酪蛋白中分离并鉴定得到一个具有自由基淬灭能力的肽蚪ｈｅ＿Ｔｙｒ－Ｐｒｏ＿Ｇｌｕ－Ｌｅｕ。研究还证实，Ｃ．端的Ｇｌｕ－Ｌｅｕ对于该肽的抗氧化活性具有重要意义。Ｊａｅ．ＹｏｕｎｇＪｅ等（２００５）从阿拉斯加鳕鱼的水解物中分离得到了具有显著抗氧化能力的多肽，其分子量为６７２Ｄａ，序列为Ｌｅｕ?Ｐｒｏ－Ｈｉｓ?Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ。韩国的ＳｅｋｗｏｎＫ【９】（２００１年）等将碱性蛋白酶、链酶蛋白酶和胶原蛋白酶构成三步连续式膜反应器对鱼皮胶原蛋白进行酶解，酶解产物通过截留分子量为１００００的膜进行第二步酶解，反应条件为ｐＨ８．０、５０℃，酶解产物通过截留分子量为５０００的膜后进行最后一步酶解，反应条件为ｐＨ７．５、３７。Ｃ，酶解产物最后通过截留分子量为１０００的膜过滤而得到了小分子抗氧化肽。ＳｅｋｗｏｎＫ利用该技术成功地对金枪鱼胶原蛋白、阿拉斯加青鳕鱼皮胶原蛋白进行酶解，经第二步酶解后的产物显示出很强的抗氧活力。先将阿拉斯加青鳕鱼皮经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．２５分离，再采用ＳＰ．ＳｅｐｈａｄｅｘＧ（Ｃ）一２５柱，用ＮａＣｌ进行线性洗脱，并将最具有抗氧化活力的流出液用ＨＰＬＣ纯化，得到了最具抗氧化活力的两个肽段。郑冬梅与孑Ｌ保华【３４】（２００２年）通过测定不同水解度水解产物的肽分子量分布，得出：肽分子的分布都是连续的，随着水解度的增加，水解产物的肽平均分子量降低，未水解的蛋白或大肽分子和氨基酸只占少数，小肽分子的数量增加。徐力等【２８Ｊ（２００２年）研究证明，链长为２．６个氨基酸残基的玉米肤，具有蛋白质大分子不可企及的抗氧化活性。荣建华【５３】（２００２年）等利用中性蛋白酶ＡＳｌ．３９８在ｐＨ６．４、４０℃、Ｅ／Ｓ＝２％、Ｓ＝５％的条件下作用于大豆分离蛋白得到分子量小于１００００Ｄａ的抗氧化肽，这是目前报道的分子量最大的大豆抗氧化肽。ＹｏｕｌｉｎｇＸｉｏｎｇ【２Ｊ（２００４年）等对乳清蛋白水解物抗氧化肽的结构与功能相关性研究表明，水解物中肽的分子量及组成决定了蛋白水解物的抗氧化能力。王晶【３ｌＪ（２００８年）采用碱性蛋白酶（Ａｌｃａｌａｓｅ）对玉米蛋白进行水解，采用凝胶层析法对５ｈ水解物进行分离纯化，得出抗氧化最强部分的分子量范围为１４７－－－１７４５。