抗氧化玉米肽的制备及其功能与结构关系的研究 - 图文(6)

第三苹玉米肽的分离纯化及其制备３．２．３超滤室温下，采用Ｐｅｌｌｉｃｏｎ．２超滤设备，分子截留量为１０ｋＤａ、５ｋＤａ、３ｋＤａ、ｌｋＤａ的超滤膜（０．１ｍ２）进行超滤。超滤条件为：进口压，１．３ＭＰａ；出口压，Ｏ．３ＭＰａ。首先将１０Ｋａ超滤膜连接至ｌＪＰｅｌｌｉｃｏｎ．２超滤系统，回流液为分子量超过１０ｋＤａ玉米肽，透过液为分子量低于１０ｋＤａ玉米肽。将透过液用５ｋＤａ超滤膜分离，依次类推将玉米肽分离成５段不同分子量的肽段。３．２．４凝胶层析分离参，照Ａｍｅｒｓｈａｍｐ凝胶层析原理与手册的方法【６５】。采用葡聚糖凝胶（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．１５）对玉米蛋白水解物在室温下进行分离。分离条件为上样量：５％的样品５ｍＬ；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ／管；洗脱液：超纯水；色谱柱规格：①１．６ｘ１２０ｃｍ。采用紫外检测器检测，波长：２２０ｎｍ，走纸记录仪记录数据。标准曲线的制作：依据多肽的洗脱条件将标准样品缩宫素（ＭＷ１００７．１９）、还原型谷胱甘肽（ＭＷ３０７．３２）、氧化型谷胱甘肽（ＭＷ６１２．６）经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．１５分离，根据洗脱体积和分子量的对数做标准曲线。３．２．５多肽的高效液相制备将ＨｅｄｅｒａＯＤＳ．２Ｃ１８柱（０２０ｍｍｘ２５０ｍｍ）接入ＷＡＴＥＲＳ１５２５系统中，采用Ｗａｔｅｒｓ２４８７检测器，按“表３．１梯度洗脱程序”进行洗脱，根据检测波长为２８０ｎｍ（参照２２０ｎｒｎ）下紫外响应信号进行收集。制备色谱条件为柱温：３５℃；短肽浓度：５０上样量：５００１ｘＬ；检测波长：２８０ｎｍ、２２０谱纯）；流动相Ｂ：５％（ｖ／ｖ）甲醇＋０．２％甲酸。表３－１梯度洗脱程序Ｔａｂｌｅ３－１Ｔｈｅｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎｍｇ／ｍＬ；ｍ；流速：８ｍＬ／ｍｉｎ；流动相Ａ：甲醇（色３．３结果与讨论３．３．１超滤制取不同平均分子量肽段与其抗氧化活性的关系玉米蛋白水解物经超滤获得了大于１０ｋＤａ、１０．５ｋＤａ、５－３ｋＤａ、３．１ｋＤａ和小于ｌｋＤａ的五个分子量肽段的组分，将这五种组分的蛋白质浓度分别调整至ｌＪｌＯｍｇ／ｍＬ并测定其ＤＰＰＨ自由基清除率、超氧阴离子清除率以及ＡＢＴＳ自由基清除率。结果如图３．１所示。２１江南大学硕士学位论文仉７仉６仉５仉４料笾晕｛吼３仉２吼ｌ０ＭＷ≤１ｉ＜ＭＷ≤３３＜ＭＷ≤５５＜ＭＷ≤１０ＭＷ＞１０超滤肽段／ｋＤａ口ＤＰＰＨ自由基清除率口超氧阴离子清除率口ＡＢＴＳ自由基清除率图３－１不同分子量的肽段的抗氧化活性Ｆｉ９３－１Ｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉ、，ｉｔｙｏｆｐｅｐｔｉｄｅｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈ从图３．１可以看出，ＤＰＰＨ自由基清除能力与其分子量有显著相关性，在分子量５０００以下，随着分子量的上升而下降。在分子量５０００以上，随着分子量的上升而上升。ＡＢＴＳ自由基淬灭能力和超氧阴离子淬灭能力在分子量小于５０００时，清除率没有显著性差异，随着分子量的继续增大ＡＢＴＳ自由基清除能力减弱而超氧阴离子清除能力增强。上述结果与前人研究报道不是特别一致。丁晓雯等【６８】报道，小分子肽具有较强的抗氧化作用；据Ｃｈｅｎ理想。ＨＭ［４５】报道抗氧化肽片断多由５，－、，１６氨基酸残基组成；据任国谱等报道【６９】一般说来肽类抗氧化能力大于氨基酸和蛋白质，分子量在２０００．３０００的肽类较为解释这种不一致的原因，可能与玉米蛋白质中未完全脱除的色素物质相关。尽管原料玉米蛋白采用的是９０％含量以上的玉米蛋白，并采用三氯甲烷进行了多次脱色，但是玉米中的部分色素与蛋白质的结合能力强，很难完全脱除。这一点在实验中也被证实了，当蛋白浓度为１０ｍｇ／ｍＬ时，分子量大于５０００的肽液有明显的淡黄色，色素特征吸收Ａ４４５较高。３．３．２超滤中分子量小于１０００肽段的组成与抗氧化活性的关系玉米蛋白水解物分子量小于１０００超滤组分进一步采用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．１５凝胶过滤色谱进行分离，进一步探索玉米肽分子量与抗氧化活性的关系。分离过程以缩宫素、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽为分子量标准。标准曲线如附录图２所示，ｙ＝．０．００３４ｘ＋３．２２７５（Ｒ２＝０．９９９９）。苎三皇至鲞壁箜坌查丝些垄苎型鱼采用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一１５，以超纯水洗脱液对玉米蛋白水解物中分子量小于１０００超滤组分分离，在洗脱体积分别为７０ｍＬ、ｌＯＯｍＬ、１３０ｍＬ、１８０ｍＬ洗脱出Ｉ、ＩＩ、Ⅲ、Ⅳ四个峰，结果如图３．２所示。２４２ｌ１８》｛１５臼峥妲１２弭辏．１０３０５０７０９０１１０１３０１５０１７０１９０２１０２３０２５０洗脱体积／弧乙图３．２玉米蛋白水解物（ＮＩＷ＜１０００）的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．１５分离图谱Ｆｉ９３—２Ｔｈｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｏｆｚｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（ＭＷ＜１０００）ｓｅｐｅｒａｔｅｄｗｉｔｈＳｅｐｈａｄｅｘＧ一１５图３．２为小于１０００超滤组分ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．１５分离图谱，从图谱玉米蛋白水解物中０．１０００肽段混合肽组成复杂，分离度不大。对Ｉ、Ⅱ、ＩＩＩ、Ⅳ四个峰反复收集后，分别用ＤＰＰＨ自由基清除法和超氧阴离子清除法测其抗氧化活性，结果如图３—３所示。０Ｏ．５．４５４００．．３５３０．斟篮蜒０．２５０２．０．１５１００．．０５０ＩＩＩＩＩＩＩＶ凝胶层析收集组分日ＤＰＰＨ自由基清除率图３－３Ｓｅｐｈａｄｅｘ口超氧阴离干清除率Ｇ一１５凝胶过滤色谱分离产物的抗氧化性Ｆｉｇ．３－３ＴｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｚｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓｅｐａｒａｔｅｄｗｉｔｈＳｅｐｈａｄｅｘＧ?１５２３江南大学硕士学位论文Ｉ、ＩＩ、Ⅲ和Ⅳ四部分是平均分子量由大到小，分别为９７６、７７１、５６４和４１２。从图３．３可以看出，ＤＰＰＨ自由基淬灭能力在ＩＩ最弱，Ⅳ最强；而超氧阴离子淬灭能力在Ⅱ最强。这个结果进一步证实，不同分子量的肽分子其抗氧化能力是不同的，抗氧化机理也是不同的。３．３．３玉米蛋白水解物极性与抗氧化性的关系上述研究显示，肽分子量与肽的抗氧化能力相关。前人研究也显示，肽是否含有某些氨基酸如酪氨酸和色氨酸【４５，５２１对其抗氧化性也有影响。本试验采用反相高效液相色谱（ＲＰ．ＨＰＬＣ）对玉米蛋白水解物分子量Ｏ一１０００超滤组分进行进一步分离并富集，试图探讨肽的极性与其抗氧化活性的相关性。图３．４反相高效液相分离玉米水解产物的色谱图（２８０ｈｍ）Ｆｉ９３—４ＴｈｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｚｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓｅｐａｒａｔｅｄｗｉｔｈＲＰ—ＨＰＬＣ（２８０ｎｍ）图３．４分别为对分子量０．１０００肽段采用ＨｅｄｅｒａＯＤＳ．２Ｃ１８反相高效液相分离２８０ｎｍ色谱图。反相高效液相色谱分离Ｏ．１０００Ｄａ肽段时，根据２８０ｎｍ色谱图（参照附录图４）收集获得２３个不同极性的组分，重复收集后将各个组分的蛋白浓度调整到１０Ｉ＿ｔｇ／ｍＬ，采用ＤＰＰＨ自由基清除法、ＡＢＴＳ自由基清除法和超氧阴离子清除法分别测定２３个组分的抗氧化能力，结果分别见图３—５、图３—６和图３－７。２４第三章玉米肽的分离纯化及其制各０．２１０．１８０．１５斟莲。捌｛Ｉ姐皿０田钆山１２０９口０．０６０．０３０ｌ３５７９１１１３１５１７１９２１２３反相液相各洗脱组分图３－５反相ＨＰＬＣ分离组分的ＤＰＰＨ自由基淬灭能力Ｆｉｇ３－５ＴｈｅＤＰＰＨｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｅｐａｒａｔｅｄｗｉｔｈＲＰ－ＨＰＬＣ１０．９０．８０７０６０５斟篮呈｛卅砸区师辎０４０．３０．２０．１０１３５７９１１１３１５１７１９２ｌ２３反相色谱各洗脱组分图３－６反相ＨＰＬＣ分离组分的超氧阴离子淬灭能力Ｆｉｇ３—６ＴｈｅｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｅｐａｒａｔｅｄｗｉｔｈＲＰ—ＨＰＬＣ