C18 4.6×250mm 5μ）；流动相：乙腈（流动相A）-0.02mol/L乙酸铵（pH=4.6）（流动相B），梯度洗脱，洗脱梯度程序见表8；检测波长：260nm；柱温：35℃。
表8 流动相洗脱梯度表 时间（min）
0.0 9.0 10.0 12.0 18.0 18.5 26.0 3、溶液的制备
3.1 参照物溶液的制备 取葛根素对照品适量，精密称定，加60%乙醇制成每1ml含葛根素0.2mg的溶液，即得。
3.2 对照品溶液的制备 取大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含大豆苷0.5mg、染料木苷0.25mg、大豆素0.25mg和染料木素0.25mg的混合溶液，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。
3.3 对照药材溶液的制备 取葛根对照药材约0.5g,置锥形瓶中，加60%乙醇50ml，加热回流30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材溶液。
3.4 供试品溶液的制备 取本品50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加60%乙醇适量，超声处理30分钟，放冷至室温，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4、测定方法 分别吸取参照物溶液、对照品溶液、对照药材溶液与供试品溶液各10μl，按照“2”项色谱条件，注入液相色谱仪，测定，即得。见色谱图11、12、13、14。
流速（ml/min）
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
A（%） 20 30 30 48 48 20 20
B（%） 80 70 70 52 52 80 80
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图11 参照物溶液色谱图 图12 对照溶液色谱图
图13 对照药材溶液色谱图 图14 样品溶液色谱图
峰1（峰S）：葛根素 峰2：未知峰 峰3：大豆苷 峰4：染料木苷 峰5：大豆素
5、测定方法的确立 5.1 流动相的选择
】参考相关文献【7，，用甲醇-水、甲醇-0.02mol/L乙酸铵（pH=4.6）、乙腈-
水、乙腈-0.02mol/L乙酸铵（pH=4.6）等多种流动相进行试验，结果经过对不同流动相所记录的色谱图的综合分析与比较（保留时间、理论板数、分离度、拖尾因子），以乙腈-0.02mol/L乙酸铵（pH=4.6），梯度洗脱为流动相效果最好，故确定流动相为乙腈-0.02mol/L乙酸铵（pH=4.6）进行梯度洗脱。
5.2 检测波长的确定
取葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素对照品溶液在200～400nm波长范围内进行紫外扫描，结果分别在250nm、260nm、261nm、249nm、261nm波
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长处有最大吸收，综合考虑，确定260nm为本试验的检测波长。见紫外扫描图1
A 葛根素 B 大豆苷 C 染料木苷
D 大豆素 E 染料木素
紫外扫描图1
5.3 专属性试验 取空白溶剂、参照物溶液、对照品溶液、对照药材溶液与供试品溶液各10μl，按照“2”项色谱条件，注入液相色谱仪，结果样品溶剂不干扰测定。
5.4 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，结果各共有峰的相对保留时间的RSD及峰面积的RSD见表9。
表9 精密度试验结果表 a 各共有峰的相对保留时间
进样 相 次数 对保 峰号 留时间 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 平均 RSD(%) 1.000 1.065 1.354 1.991 3.210 1.000 1.065 1.351 1.989 3.203 1.000 1.065 1.354 1.994 3.210 1.000 1.065 1.354 1.994 3.210 18
1.000 1.065 1.354 1.994 3.210 1.000 1.065 1.354 1.994 3.210 1.000 1.065 1.354 1.992 3.208 0.000 0.005 0.088 0.090 0.088
b 各共有峰的峰面积
进样 次数 峰 峰号 面积 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 平均 RSD(%) 110.215 111.026 111.105 111.786 111.102 111.252 111.047 29.225 47.319 5.882 3.690 28.954 47.734 5.960 3.712 29.274 48.375 5.967 3.689 29.351 48.316 5.952 3.683 29.379 48.297 5.927 3.658 29.322 48.166 5.906 3.649 29.237 48.008 5.938 3.686 0.502 0.579 0.967 0.582 0.524
结果表明精密度良好。
5.5重复性试验 取同一批样品的均匀细粉，取50mg，精密称定，置50ml量瓶中，共6份，照“3.4”项方法制备供试品溶液，结果各共有峰的相对保留时间的RSD 及峰面积的RSD见表10。
表10 重复性试验结果表 a 各共有峰的相对保留时间
供试品 相 溶液 对保 峰号 留时间 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 平均 RSD(%) 1.000 1.065 1.353 1.987 3.198 1.000 1.065 1.353 1.987 3.198 1.000 1.067 1.353 1.987 3.198 1.000 1.065 1.353 1.985 3.198 1.000 1.065 1.353 1.987 3.198 1.000 1.065 1.353 1.985 3.198 1.000 1.065 1.353 1.986 3.198 0.000 0.082 0.000 0.056 0.000
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b 各共有峰的峰面积 F值=各峰峰面积/取样量
供试品 溶液 峰号 F值 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 平均 RSD(%) 2.969 0.459 0.860 0.136 0.356 2.943 0.453 0.862 0.137 0.358 2.954 0.456 0.857 0.137 0.358 2.928 0.452 0.855 0.136 0.357 2.927 0.450 0.856 0.137 0.355 2.974 0.459 0.870 0.139 0.359 2.949 0.455 0.860 0.137 0.357 0.685 0.833 0.653 0.753 0.420 结果表明重复性良好。
6、样品测定结果 称取本品适量，照“3.4”项方法制备供试品溶液，按上述方法进行测定，测得结果见表11。
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