细菌数是指规定单位的非规定灭菌药品制剂中污染活细菌的数量。是判定药品受到细菌污染程度的标志。其内含是多义的。细菌数愈多，表明药品受到致病微生物污染的可能性以及药品制剂的变质可能性也愈大，安全性也就越差。同时细菌数测定也是对生产单位的药品原辅料、器具设备、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。
细菌数测定采用平板菌落计数法，是一种活菌计数法。测定结果只反映出在规定条件下生长的细菌数，不可能包括在本法条件下不生长的细菌，因而测定数只可能低于实际的污染数。此外，测定中１个细菌可能繁殖成１个菌落，而一群也可能只形成１个菌落，以及污染的不均匀性等等原因，极易造成测定差异。故在测定细菌数时，必须严格按本法所规定条件操作。 １．培养基、试剂
１．１ 肉汤琼脂（或０．００１％ＴＴＣ肉汤琼脂）（附录三２，４） １．２ ＰＨ７．２磷酸盐缓冲液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）或生理盐水（附录二） ２．检验程序
－－－－－ 制备 －－－－－－ 稀释 －－－－－－－ 稀释 －－－－－－－－ ｜供试品｜－－→｜１∶１０｜－－－→｜１∶１００｜－－－→｜１∶１０００｜ －－－－－ ｜ 供试液｜ ｜ 供试液 ｜ ｜ 供试液 ｜ －－－－－－ －－－－－－－ －－－－－－－－ ↓１ｍｌ ↓１ｍｌ ↓１ｍｌ －－－－－－ －－－－－－－ －－－－－－－－ ｜ 平皿 ｜ ｜ 平皿 ｜ ｜ 平皿 ｜ ｜２～３个｜ ｜ ２～３个｜ ｜ ２～３个 ｜ －－－－－－ －－－－－－－ －－－－－－－－ ｜ ｜ ｜ －－－－－－－－－－－↓－－－－－－－－－－ －－－－－－－ ｜ 注皿 ｜ －－－－－－－ ↓ 干燥 －－－－－－－ ｜ 培养 ｜ －－－－－－－ ３０～３５℃↓４８±２小时 －－－－－－－ ｜ 菌落计数｜ －－－－－－－ ↓ －－－－－－－
｜ 报告 ｜ －－－－－－－ ３．操作步骤
３．１ 供试液制备，经阴性对照取样后，按各类制剂制备供试液的方法（总则５）制备。 ３．２ 稀释及吸样 稀释级一般应采用３级。
稀释 取１ｍｌ吸管１支，吸取混匀的１∶１０供试液（或原液、１∶２０供试液）１ｍｌ，在离稀释剂液面上约１ｃｍ处，沿管壁注入装有９ｍｌ的稀释剂的试管中，混匀成１∶１００（或１∶１０、１∶２００）的稀释液。
吸样 用上述吸管分别取１∶１０供试液（或原液、１∶２０供试液）１ｍｌ，注入２～３个平皿中。 以另一支１ｍｌ吸管，按上述操作，作下一级的稀释与吸样。
操作时，应特别注意每次吸液前必须使稀释液充分混匀（吸管反复吹吸数次或充分震荡），以使菌体充分均匀分散，降低测定误差。 ３．３ 倾注琼脂（注皿）与干燥
３．３．１ 事先将肉汤琼脂融化、置４５℃水浴中，备用
３．３．２ 当供试液及各级稀释液均注入平皿后，以上述琼脂倾注入平皿，每皿约１５ｍｌ，随即转动平皿，使样液与琼脂混匀后置水平台上待凝。
３．３．３ 干燥 琼脂凝固后，在净化条件下开盖倒置或换灭菌的陶瓦盖，使平板干燥，减少平板表面的水分，防止菌落蔓延生长。干燥时间一般在３小时左右，干燥时间计入培养时限。 ３．４ 将上述平板倒置于３０～３５℃培养箱中，培养４８±２小时。 ４．菌落计数
４．１ 细菌菌落是１个菌细胞或菌细胞团在局限位置上，经一定条件繁殖成肉眼可见的细菌群体。由于细菌种类繁多，形成菌落大小、形状、色泽、透明度等皆因种而异，差别甚大。计数时一般用透射光于平板背面或正面仔细观察。不要漏计琼脂层内和平板边缘生长的菌落。并须注意细菌菌落与药渣或培养基的沉淀物，酵母菌及霉菌菌落的区别。必要时，用显微镜鉴别。
４．２ 用肉眼直接计数、标记或在菌落计数器上点计，然后用５～１０倍放大镜检查，有否遗漏。 ４．３ 若平板上有２个或２个以上的菌落重叠，可分辨时仍以２个或２个以上菌落计数。 ４．４ 平板上有片状菌落或花斑样菌落蔓延生长以及平板受到污染的情况，该平板计数无效。 ４．５ 计算各稀释级平均平板菌落数。
４．５．１ 当用一稀释级使用２个平板时，应采用２个平板菌落数的均值为平均平板菌落数。若２个平板菌落数相差在１倍以上时，该稀释级不宜采用，但不包括２个平板菌落数均在１５个以下的情况①。 注① １５以下两平板菌落数允许幅度０～４、１～７、２～９、３～１０、４～１２、５～１４、６～１５、７～１７、８～１８、９～１９、１０～２０。
４．５．２ 当同一稀释级使用３个平板时，应采用３个平板菌落数的均值为平均菌落数。若其中１个平板菌落数与其他２个相近的平板菌落数的均值相差１倍以上时，该平板菌落数不能参与平均，但不包括平板菌落数均在１０个以下的情况②。
注② １０以下３平板最大与最小菌落数的允许幅度，０～３、１～５、２～７、３～９、４～１０、
５～１２、６～１３、７～１４。 ５．菌数报告规则
一般宜选取平均平板菌落数在３０～３００间的稀释级，作为菌数计算的依据。
５．１ 若有１个稀释级的平均平板菌落数处在３０～３００时，将该稀释级的平均平板菌落数乘以稀释倍数，为报告菌数。
５．２ 若有２个稀释级的平均平板菌落数处在３０～３００时，先计算两稀释级菌落数的比值。 高稀释级的平均平板菌落数×稀释倍数 比值＝－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 低稀释级的平均平板菌落数×稀释倍数
５．２．１ 当比值≤２时，以两级的菌落数均值为报告菌数。
５．２．２ 当比值＞２时，以低稀释级平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。
５．３ 若有３个稀释级的平均平板菌落数均处在３０～３００时，采用后２个稀释级计算级间比值。 ５．３．１ 当比值≤２时，以两级的菌落数的均值为报告菌数。
５．３．２ 当比值＞２时，以低稀释级平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。
５．４ 若各稀释级平均平板菌落数均在３００以上，按最高的稀释级的平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数，或适当增加稀释级，重作测定后报告结果。
５．５ 若各稀释级的平均平板菌落数均不在３０～３００间，其中一稀释级的平均平板菌落数大于３００，相邻稀释级的平均平板菌落数又小于３０时，以最接近３０或３００的稀释级平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。
５．６ 若各稀释级平均平板菌落数均小于３０时，按最低稀释级的平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。但若应用原液为供试液，当１∶１０稀释级与原液的平均平板菌落数相等或大于时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。 培养基稀释法：
吸取供试液（原液或１∶１０供试液）１ｍｌ，注入５个平皿内（每皿０．２ｍｌ，总量为１ｍｌ）。共作３份，共１５个平皿。每皿倾注融化并冷至４５℃左右的普通肉汤琼脂约１５ｍｌ，旋转混合，冷凝后按规定培养温度与时限培养、计数。
将每ｍｌ注入５个平板的菌落计数结果合并为每ｍｌ菌落数，共得３组数据。取３组数据平均值乘稀释倍数，为报告菌数。
５．７ 若各稀释级的平均平板菌落数均无菌落生长或测定数在１０个以下时，报告菌数为＜１０个。 表１： 细菌数报告规则举例
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ｜ ｜ ｜ 供试品稀释倍数 ｜级间｜ ｜ 报告数 ｜ ｜ 规则｜ 原液｜－－－－－－－－－－－｜ ｜ 菌落数｜ ｜ ｜ ｜ ｜ －1 ｜ －2 ｜ －3 ｜比值｜ ｜ 书 写 ｜ ｜ ｜ ｜10 ｜10 ｜10 ｜ ｜ ｜ ｜
｜－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－｜ ｜ 5.1 ｜ － ｜1365 ｜ 164 ｜ 20 ｜ －｜ 16400 ｜ 16×10 或16000 ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ 3 ｜ ｜5.2.1 ｜ － ｜2760 ｜ 295 ｜ 46 ｜1.6 ｜ 37750 ｜ 38×10 或38000 ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ 3 ｜ ｜5.2.2 ｜ － ｜2890 ｜ 271 ｜ 60 ｜2.2 ｜ 27100 ｜ 27×10 或27000 ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ 3 ｜ ｜5.3.1 ｜ － ｜ 239 ｜ 202 ｜ 35 ｜1.7 ｜ 27600 ｜ 28×10 或28000 ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ 3 ｜ ｜5.3.2 ｜ － ｜ 236 ｜ 196 ｜ 42 ｜2.1 ｜ 19600 ｜ 20×10 或20000 ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ 4 ｜ ｜ 5.4 ｜ － ｜不可计｜4650 ｜ 513 ｜ －｜513000 ｜51×10 或510000 ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ 3 ｜ ｜ 5.5 ｜ － ｜不可计｜ 305 ｜ 12 ｜ －｜ 30500 ｜ 30×10 或30000 ｜ ｜ 5.6 ｜ － ｜ 24 ｜ 19 ｜ 12 ｜ －｜ 240 ｜ 24×10或240 ｜ ｜ 5.6 ｜ 22.3 ｜ 27 ｜ 7 ｜ － ｜ －｜ 270 ｜ 27×10或270 ｜ ｜ 5.7 ｜ － ｜ 0.6 ｜ 0 ｜ 0 ｜ －｜ 6 ｜ ＜10 ｜ －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ６．报告数书写
６．１ 菌落数在１００个以内时，按实测数书写报告。
６．２ 菌落数大于１００时，取二位有效数字，第三位数按有效数字处理规则处理，为简便计，也可用１０的指数报告。 霉菌和酵母菌数测定
霉菌和酵母菌数是指规定单位非规定灭菌药品制剂中污染的霉菌和酵母菌的活菌数量。
霉菌和酵母菌广泛分布于自然界，土壤、空气及水中都有它们的菌体及孢子存在。因而在药品生产、贮藏等各个环节均可污染药品，以致引起药品变质，危害人体健康。有些霉菌毒素也是重要的致癌物质。 霉菌和酵母菌数是判定药品受到污染程度的标志之一，也是对药品原料、生产工艺、生产环境以及操作人员卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。
霉菌和酵母菌种属繁多，采用一种培养基和培养条件，不可能适合所有霉菌和酵母菌的生长繁殖。故本法测定结果只能是在一定条件下平板生长的霉菌和酵母菌菌落数。本法规定，一般制剂用虎红琼脂作霉菌数测定（液体制剂包括酵母菌数）。但含蜂蜜或王浆的合剂另以酵母膏，蛋白胨、葡萄糖（ＹＰＤ）琼脂作酵母菌数测定，而霉菌数测定仍用虎红琼脂。 １．培养基、试剂
１．１ ＰＨ７．２磷酸盐缓冲液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）（附录二２） １．２ 生理盐水（附录二２）
１．３ ＹＰＤ琼脂培养基（附录三６）
１．４ 虎红琼脂培养基（附录三５） ２．检验程序
－－－－－ －－－－－－－ －－－－－－－ －－－－－－－－ ｜供试品｜－－→｜1:10供试液｜－－→｜1:100供试液｜－→ ｜1:1000供试液｜ －－－－－ －－－－－－－ －－－－－－－ －－－－－－－－ ｜ 合剂（含蜂蜜或 ｜ ｜ ｜ ｜ 王浆者） ｜ ｜ ｜ ↓ 滴眼剂 ↓ ↓ ↓ －－－－－－－ －－－－－－－ －－－－－－－ －－－－－－－－ ｜平皿2～3个｜ ｜平皿2～3个｜ ｜平皿2～3个｜ ｜平皿２～３个｜ －－－－－－－ －－－－－－－ －－－－－－－ －－－－－－－－ ｜ ｜ ｜ ｜ －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ↓
－－－－－－－－－－－－－－－－ ｜ 虎红琼脂，ＹＰＤ琼脂 ｜ ｜（含蜂蜜或王浆的合剂用）注皿｜ －－－－－－－－－－－－－－－－ ↓ －－－－－－－ ｜ 培 养 ｜ －－－－－－－ ２５～２８℃↓７２±２小时 －－－－－－－－－ ｜ 菌落计数 ｜ －－－－－－－－－ ↓ －－－－－－－ ｜ 报 告 ｜ －－－－－－－ ３．操作步骤
３．１ 供试液的制备（总则５）与稀释，按细菌数测定项下的方法进行。稀释级一般采用３级。合剂（含蜂蜜或王浆者）和滴眼剂可用原液作第１级供试液，分别在作１０倍递增稀释的同时，即可取该稀释级的吸管吸取１ｍｌ稀释液于灭菌平皿内，每个稀释级２～３个平皿。
３．２ 各稀释液注入平皿后，应及时将融化并冷至４５℃左右的虎红琼脂培养基（如供试品为含蜂蜜或王浆的合剂，加用ＹＰＤ琼脂培养基测定酵母菌数）约１５ｍｌ倾注平皿内，摇匀待凝。