１．９ 氯仿 ２．检验程序
－－－－－ ｜供试品｜ －－－－－ ｜ －－－－－ ｜供试液｜ －－－－－ ｜ －－－－－－－－－ ｜胆盐乳糖增菌液｜ －－－－－－－－－ ３６±１℃ ｜１８～２４小时 －－－－－－－－－－－－－ ｜十六烷二甲基溴化铵平板｜ －－－－－－－－－－－－－ ３６±１℃ ｜１８～２４小时 －－－－－－－－－－ ｜普通肉汤琼脂斜面｜ －－－－－－－－－－ ３６±１℃ ｜１８～２４小时 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ｜ ｜ －－－－－－－－－ －－－－－－－ ｜革兰氏染色镜检｜ ｜氧化酶试验｜ －－－－－－－－－ －－－－－－－ ｜
－－－－－－－－－－ 阳性 ｜ ｜阴性 －－－－－－－－ －－－－ ｜绿脓菌素试验｜ ｜报告｜ －－－－－－－－ －－－－ ｜
－－－－－－－－－－－－－－－ 阴性 ｜ ｜阳性
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ －－－－ ｜ ｜ ｜报告｜ －－－－－－ －－－－－－－ －－－－－－－ －－－－ ｜明胶液化｜ ｜硝酸盐还原｜ ｜４２℃生长｜ ｜ 试验 ｜ ｜产气试验 ｜ ｜ 试 验 ｜ －－－－－－ －－－－－－－ －－－－－－－ ｜ ｜ ｜ －－－－－－－－－－－－－－－－－－ ｜ －－－－ ｜报告｜ －－－－ ３．操作步骤 ３．１ 增菌培养
取供试液（总则５）１０ｍｌ，接种于１００ｍｌ胆盐乳糖增菌液中（滴眼剂可接种于普通肉汤中），置３６±１℃培养１８～２４小时。如有绿脓杆菌生长，培养液变混，液面多有１层菌膜，表层常呈黄绿或蓝绿色。
含有抑菌成分的滴眼剂等液体制剂，可取供试品２ｍｌ，用薄膜过滤法（总则５．３．２）过滤并冲洗滤膜，将滤膜剪成２片，分置于２瓶１００ｍｌ胆盐乳糖增菌液或（或普通肉汤）中（与金黄色葡萄球菌同时检验时，取样４ｍｌ，过滤后剪成４片，分置于二种增菌液４瓶中），其中１瓶加入规定量的对照菌作阳性对照。置３６±１℃培养１８～２４小时。
３．２ 分离培养 以接种环沾取增菌培养液（如有菌膜，应挑取之），划线于十六烷三甲基溴化铵琼脂平板，于３６±１℃培养１８～２４小时。
绿脓杆茵在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上的典型菌落为扁平无定形，边缘不齐，周边呈扩散现象，常互相融合，表面湿润、无光泽、呈灰白色。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色。但亦有不产色素的菌株，菌落亦有粗糙型和侏儒型等。应注意挑选。
分离平板若无菌落生长，可作出“未检出”报告。若生长，以接种针沾取２～３个疑似菌落培养物分别接种至肉汤琼脂斜面上，３６±１℃培养１８～２４小时。
３．３ 革兰氏染色镜检 取普通肉汤琼脂斜面培养物，涂片、革兰氏染色，镜检。绿脓杆菌为革兰氏阴性、无芽孢杆菌，菌体长短不一，可呈多形性排列、成双或短链状。本菌体一端有１根鞭毛，以活体观察，可见活泼动力，以鞭毛染色法（附录二、１２）可见单端鞭毛。 ３．４ 生化试验
３．４．１ 氧化酶试验 取一小块白色洁净的滤纸片置平皿内，以无菌玻璃棒挑取肉汤琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸片上，随即滴加１滴新配制的１％盐酸二甲基对苯二胺试剂，在３０秒钟内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，氧化酶试验为阳性，可作出未检出绿脓杆菌报告。
３．４．２ 绿脓菌素试验 取肉汤琼脂斜面培养物，接种在测定绿脓菌色素用的ＰＤＰ琼脂斜面上，
置３６±１℃培养２４小时后，在试管内加氯仿３～５ｍｌ，搅碎并充分振摇，使培养物中的色素提取在氯仿液内。待氯仿提取液呈蓝绿色时，用毛细管将其移至另一试管中，并在该液中加盐酸液（１ｍｏｌ／Ｌ）约１ｍｌ，振摇后，静置片刻，如在盐酸液层内出现粉红色，即为阳性；无粉红色出现，为阴性反应。对阴性反应的培养物，应再接种ＰＤＰ琼脂斜面，置３６±１℃培养２～３天后，再行检查。 凡氧化酶试验阳性、绿脓菌素阳性及革兰氏阴性杆菌的培养物，可作出检出绿脓杆菌的报告。 上述试验结果中，绿脓菌素阴性反应的培养物，应继续进行以下试验。
３．４．３ 硝酸盐还原产气试验 以接种环沾取普通肉汤琼脂斜面培养物，接种于硝酸盐胨水培养基中，置３６±１℃培养２４小时，观察结果。如在培养基的小倒管中有气体产生，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
３．４．４ ４２℃生长试验 以接种环挑取普通肉汤琼脂斜面培养物于灭菌盐水中，制成菌悬液，然后取菌悬液接种于肉汤琼脂斜面上，立即置４１±１℃水浴箱中培养２４～４８小时，斜面若有菌苔生长者为阳性；反之为阴性。
３．４．５ 明胶液化试验 以接种针沾取普通肉汤琼脂斜面培养物，穿刺接种于明胶培养基内，置３６±１℃培养２４小时，取出放冰箱内１０～３０分钟。如培养基仍呈溶液状，即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者，为阴性反应。 ４．结果报告
４．１ 被检样品培养物，经证实为革兰氏阴性杆菌、氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告检出绿脓杆菌。
４．２ 若氧化酶试验阳性的革兰氏阴性杆菌的培养物，绿脓菌素试验为阴性时，硝酸盐还原产气试验，４２℃生长试验及明胶液化试验皆为阳性，亦应报告检出绿脓杆菌。 ４．３ 与４．１及４．２的结果不符时，报告未检出绿脓杆菌。 表７： 绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌的主要特性鉴别表
┌────────┬──┬────────┬──┬─┬─┬──┬─┬──┬─┬──┐ │＼ │分离│ 色素 │ 鞭 │氧│氧│ 乙 │精│硝酸│液│42℃│ │ ＼ 鉴 ├──┼──┬──┬──┤ 毛 │化│化│ 酰 │氨│盐还│化│ 生 │ │ 菌 ＼ 别 │十六│ 绿 │ 萤 │ 其 │ 染 │葡│酶│ 氨 │酸│原产│明│ 长 │ │ ＼ │烷三│ 脓 │ 光 │ 他 │ 色 │萄│ │ 酶 │双│气 │胶│ 试 │ │ ＼ 培 │甲基│ 菌 │ 色 │ 色 │ │糖│ │ │水│ │ │ 验 │ │ 种 ＼ 养│溴化│ 素 │ 素 │ 素 │ │ │ │ │解│ │ │ │ │ ＼ │铵琼│ │ │ │ │ │ │ │酶│ │ │ │ │ ＼│脂 │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ ├────────┼──┼──┼──┼──┼──┼─┼─┼──┼─┼──┼─┼──┤ │绿脓杆菌 │ + │+/- │+/- │+/- │端极│+ │+ │ + │+ │ + │+ │ + │ │(P.aeruginosa) │ │ │ │ │单毛│ │ │ │ │ │ │ │ ├────────┼──┼──┼──┼──┼──┼─┼─┼──┼─┼──┼─┼──┤ │萤光假单胞菌 │+/- │ - │+/- │ - │端极│+ │+ │-/+ │+ │-/+ │+ │ - │
│(P.fluorescens) │ │ │ │ │多毛│ │ │ │ │ │ │ │ ├────────┼──┼──┼──┼──┼──┼─┼─┼──┼─┼──┼─┼──┤ │恶臭假单胞菌 │+/- │ - │+/- │ - │端极│+ │+ │-/+ │+ │ + │- │ - │ │(P.putida) │ │ │ │ │多毛│ │ │ │ │ │ │ │ ├────────┼──┼──┼──┼──┼──┼─┼─┼──┼─┼──┼─┼──┤ │洋葱假单胞菌 │ - │ - │ - │-/+ │端极│+ │+ │-/+ │- │ - │+ │-/+ │ │(P.cepacia) │ │ │ │ │多毛│ │ │ │ │ │ │ │ ├────────┼──┼──┼──┼──┼──┼─┼─┼──┼─┼──┼─┼──┤ │类鼻疽假单胞菌 │ - │ - │ - │ - │端极│+ │+ │ - │+ │ - │+ │ + │ │(P.pseudomallei)│ │ │ │ │多毛│ │ │ │ │ │ │ │ ├────────┼──┼──┼──┼──┼──┼─┼─┼──┼─┼──┼─┼──┤ │嗜麦芽假单胞菌 │ - │ - │ - │ - │端极│+ │- │ - │- │ - │+ │ - │ │(P.maltophilia) │ │ │ │ │多毛│ │ │ │ │ │ │ │ ├────────┼──┼──┼──┼──┼──┼─┼─┼──┼─┼──┼─┼──┤ │腐败假单胞菌 │ - │ - │ - │ - │端极│+ │+ │ - │- │ - │+ │-/+ │ │(P.putrefaciens)│ │ │ │ │单毛│ │ │ │ │ │ │ │ ├────────┼──┼──┼──┼──┼──┼─┼─┼──┼─┼──┼─┼──┤ │司氏假单胞菌 │ - │ - │ - │ - │端极│+ │+ │ - │- │ + │+ │+/- │ │(P.stutzeri) │ │ │ │ │单毛│ │ │ │ │ │ │ │ ├────────┼──┼──┼──┼──┼──┼─┼─┼──┼─┼──┼─┼──┤ │产碱假单胞菌 │ - │ - │ - │ - │端极│- │+ │ - │- │ - │- │ + │ │(P.alcaligenes) │ │ │ │ │单毛│ │ │ │ │ │ │ │ ├────────┼──┼──┼──┼──┼──┼─┼─┼──┼─┼──┼─┼──┤ │类产碱假单胞菌 │ - │ - │ - │ - │端极│- │+ │ - │- │ - │- │ + │ │(P.pseudoal- │ │ │ │ │单毛│ │ │ │ │ │ │ │ │caligenes) │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ ├────────┼──┼──┼──┼──┼──┼─┼─┼──┼─┼──┼─┼──┤ │氧化木糖无色杆菌│ + │ - │ - │ - │周毛│+ │+ │ + │- │ + │- │ + │ │(A.xylosoxidans)│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ ├────────┼──┼──┼──┼──┼──┼─┼─┼──┼─┼──┼─┼──┤ │产碱杆菌属 │-/+ │ - │ - │ - │周毛│- │+ │-/+ │- │-/+ │- │ + │ │(Alcaligenes. SP│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │SP.) │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ ├────────┼──┼──┼──┼──┼──┼─┼─┼──┼─┼──┼─┼──┤ │粪产碱杆菌 │ + │ - │ - │ - │周毛│- │+ │ + │- │-/+ │- │ + │ │(Afaecalis) │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ └────────┴──┴──┴──┴──┴──┴─┴─┴──┴─┴──┴─┴──┘
注“＋／－表示多数阳性，少数阴性。－／＋表示多数阴性，少数阳性。 金黄色葡萄球菌检验法
金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属细菌。本菌在自然界分布甚广，空气、土壤、水和日常用具，人的皮肤、鼻咽腔、痰液、鼻涕、毛囊等常可发现，故在生产各环节中极易污染药品。本菌是葡萄球菌中致病力最强的一种，能引起局部及全身化脓性炎症，严重时可导致败血症。故外用药品和一般眼科制剂规定不得检出金黄色葡萄球菌。 １．培养基、试剂
１．１ 普通肉汤培养基（附录三１） １．２ 亚碲酸钠北沙参胨水（附录三２７） １．３ 亚碲酸钠肉汤（附录三２６） １．４ 卵黄高盐琼脂（附录三２８） １．５ 甘露醇高盐琼脂（附录三２９） １．６ 普通肉汤琼脂（附录三２） １．７ 血浆（１∶１）（附录二４） ２．检验程序
－－－－－ ｜供试品｜ －－－－－ ↓ －－－－－ ｜供试液｜ －－－－－ ↓
－－－－－－－－－－－－－ ｜ 亚碲酸钠肉汤或 ｜ ｜北沙参胨水或普通肉汤 ｜ －－－－－－－－－－－－－ ３６±１℃ ↓ ２４小时 －－－－－－－－－ ｜卵黄高盐琼脂或｜ ｜甘露醇高盐琼脂｜ －－－－－－－－－ ３６±１℃ ↓２４～４８小时 －－－－－－－－－－ ｜普通肉汤琼脂斜面｜ －－－－－－－－－－