３６±１℃ ↓ ２４小时
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ｜ ｜
－－－－－－－－－－ －－－－－－－－－ ｜革兰氏染色、镜检｜ ｜血浆凝固酶试验｜ －－－－－－－－－－ －－－－－－－－－ ｜ ｜ －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ↓ －－－－ ｜报告｜ －－－－ ３．操作步骤
３．１ 增菌培养 取供试液（总则５）１０ｍｌ，接种于备妥的１００ｍｌ亚碲酸钠肉汤或亚碲酸钠北沙参胨水增菌液（滴眼剂、化学药品供试液可接种普通肉汤），置３６±１℃培养２４小时。 含有抑菌成分的滴眼剂等液体制剂，可取样２ｍｌ，采用薄膜过滤法（总则５．３．２），将滤膜分成２片，分别接种２瓶１００ｍｌ上述增菌液中（与绿脓杆菌同时检验时，取样４ｍｌ，过滤后将滤膜剪成４片，分置于二种增菌液４瓶中），其中１瓶加入规定量的对照菌作阳性对照试验，置３６±１℃培养１８～２４小时。若有菌生长，增菌液变混。
３．２ 分离培养 轻微摇动增菌培养液，以接种环沾取１～２环，划线接种于卵黄高盐琼脂或甘露醇高盐琼脂平板，置３６±１℃培养２４～７２小时。 金黄色葡萄球菌在上述平板上的典型菌落形态见表８ 表８： 金黄色葡萄珠菌在选择培养基上的菌落特征
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ｜ 培 养 基 ｜ 菌 落 形 态 特 征 ｜ ｜－－－－－－－｜－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－｜ ｜卵黄高盐琼脂 ｜金黄色，圆形突起，边缘整剂，外周有卵磷脂被分解的乳浊｜ ｜ ｜圈。菌落直径１～２ｍｍ ｜ ｜－－－－－－－｜－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－｜ ｜甘露醇高盐琼脂｜金黄色，圆形突起，边缘整齐，外周有黄色环，菌落直径约｜ ｜ ｜１ｍｍ ｜ －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
金黄色葡萄球菌在上述培养基上产生的色素，典型者为金黄色，但有的菌株可因来源不一或受药物影响，可呈橙黄、黄、白或无色。培养基存放时间和培养时间长短对色素产生亦有影响，一般以新配培养基、培养时间较长，金黄色色素较明显。
上述平板中若无菌落生长，可作出“未检出”报告。若有菌落生长，以接种针轻轻接触疑似菌落中心
部位沾取培养物，接种于普通肉汤琼脂斜面，于３６±１℃培养１８～２４小时。一般宜挑取２个以上疑似菌落进行鉴定。
３．３ 革兰氏染色镜检 取普通肉汤琼脂斜面培养物涂片，革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，无芽孢，无荚膜，排列呈不规则、堆积似葡萄状。 ３．４ 生化试验
３．４．１ 血浆凝固酶试验 取灭菌小试管３支，每管加入０．５ｍｌ１∶１血浆，吸取待检菌的肉汤培养液（或取肉汤琼脂斜面上的纯菌苔少许在生理盐水管中磨匀，使呈浓菌液）０．５ｍｌ，加入１支血浆管中，其余２支血浆管作对照管，１支加入阳性对照菌的肉汤培养液或菌悬液０．５ｍｌ作阳性对照；另１支加入肉汤或生理盐水０．５ｍｌ作阴性对照。将３管同时放在３６±１℃培养。３小时后开始检查，以后每隔适当时间观察１次，直至２４小时。检查时，轻轻将试管倾斜，仔细观察，凡阴性对照管的血浆流动自如，试验管血浆凝固者为阳性反应；经保温２４小时，试验管无凝固现象为阴性反应。每次试验，阳性对照管应出现血浆凝固，阴性对照管应不凝固。否则，应另制备血浆，重新试验。 ４．结果报告
４．１ 供试品中分离培养物为革兰氏阳性球菌，血浆凝固酶试验阳性，报告检出金黄色葡萄球菌。 ４．２ 不符合上述试验结果，报告未检出金黄色葡萄球菌 表９： 葡萄球菌属的菌种生化鉴别
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ｜ 鉴 别 试 验 ｜金黄色葡萄球菌｜表皮葡萄球菌｜腐生葡萄球菌｜ ｜－－－－－－－－－－－－｜－－－－－－－｜－－－－－－｜－－－－－－｜ ｜甘露醇产酸（需氧） ｜ ＋ ｜ ｄ ｜ ｄ ｜ ｜甘露醇产酸（厌氧） ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜ ｜血凝固酶 ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜ ｜磷酸酶 ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ － ｜ ｜耐热ＤＮＡ酶 ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜ ｜ｄ型毒素 ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜ ｜核糖醇 ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜ ｜甘油 ｜ － ｜ ＋ ｜ ｄ ｜ ｜蛋白Ａ ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜ ｜新生霉素敏感性 ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ － ｜ －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ｄ有不同反应结果 破伤风杆菌检验法
破伤风杆菌为梭状芽孢杆菌属细菌，广泛分布于土壤及人、畜的粪便中。本菌的芽孢对热抵抗力很强，湿热１００℃１小时尚能存活，干热１５０℃１小时尚能存活，在尘埃和土壤中可存活１０多年。以根茎类植物为原料的药品常可受到本菌污染，外用药特别是用于深部组织的药品污染破伤风杆菌，可导致破伤风病，死亡率很高。因此，对于某些用于阴道、创伤、溃疡的药品，必须控制破伤风杆菌。
１．培养基、试剂
１．１ ０．１％葡萄糖疱肉培养基（附录三 ３１） １．２ 新霉素葡萄糖血琼脂（附录三 ３５） １．３ １％葡萄糖血琼脂（附录三 ３３） １．４ 革兰氏染色液（附录二 １） １．５ 厌氧指示剂（附录二 ３） １．６ 破伤风抗毒素 ２．检验程序 @@ ３．操作步骤
３．１ 增菌产毒培养 称取供试品０．５ｇ，共３份，分别加至０．１％葡萄糖庖肉培养基中（如非当日配制，应于临用前煮沸５分钟，迅速冷却），其中一管约加０．０５ｍｌ经３６±１℃厌氧培养２～３天的阳性对照菌液。以上各管均置７５～８０℃水浴保温２０分钟，然后置３６±１℃厌氧培养（厌氧培养箱、罐、袋。或以１∶１凡士林石蜡封盖疱肉培养基液面）７２～９６时，观察结果。若培养液产气、消化碎肉并有臭气，应作革兰氏染色镜检和毒力试验。不产气、无消化碎肉及臭气等现象，镜检未见疑似菌者，可作出未检出破伤风杆菌报告。
３．２ 革兰氏染色镜检 取增菌产毒培养液涂片，作革兰氏染色镜检。典型的破伤风杆菌应为革兰氏阳性鼓槌样芽孢杆菌，菌体细长，成熟芽孢为正圆形，孢径大于菌体宽度，位于菌体一端，形似鼓槌状；未成熟芽孢为卵圆形，形似火柴或网球拍状，亦可见到游离散在的圆形芽孢。本菌培养时间较久，常为革兰氏染色阴性。
－－－－－ ｜供试品｜ －－－－－ ７５～８０℃ ｜２０分钟 －－－－－－－－－－－－－－ ｜０．１％葡萄糖疱肉培养基｜ －－－－－－－－－－－－－－
３６±１℃ ｜ 厌氧培养７２－９６小时 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ｜ ｜ 产气、臭气、消化碎肉，镜检阳性 无产气、臭气、消化碎肉，镜检阴性 ↓ ↓ －－－－－－ －－－－ ｜毒力试验｜ ｜报告｜ －－－－－－ －－－－ ｜
－－－－－－－－－－－－－－－
｜ ｜ 阳性 阴性 ｜ ｜
｜ －－－－－－－－－－－－－－－－－－ ｜ ｜ ｜ －－－－ －－－－－－－－－－－－－－ －－－－－－ ｜报告｜ ｜０．１％葡萄糖疱肉培养基｜－－－ ｜分离培养｜ －－－－ －－－－－－－－－－－－－－ ｜ －－－－－－
３６±１℃｜厌氧培养７２－９６小时 ｜３６±１℃｜厌氧培养７２－９６小时 －－－－－－ ｜ ↓
｜毒力试验｜ ｜－－－－－－－－－－－－－－ －－－－－－ ｜｜０．１％葡萄糖疱内培养基｜ ｜ ｜－－－－－－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－－ ｜３６±１℃↓厌氧培养７２－９６小时 阳性 阴性 ｜ －－－－－－ ↓ ↓ ｜ ｜毒力试验｜ －－－－ －－－－－－－－－－－－－－ ｜ －－－－－－ ｜报告｜ ｜０．１％葡萄糖疱肉培养基｜－｜ ｜
－－－－ －－－－－－－－－－－－－－ －－－－－－－－－－－－ ３６±１℃↓厌氧培养７２－９６小时 ｜ ｜