３．３ 凝固后，置２５～２８℃培养箱内，一般培养７２±２小时，如有可疑，可标记后适当延长培养时间。
４．菌落计数方法 ４．１ 菌落形态
４．１．１ 霉菌菌落形态：具有放射状或树状分枝的菌丝是霉菌菌落的特征。初形成时，多无色透明，有明显的折光性，在较暗的背景下，以透射光观察，易于识别。少数生长在琼脂表面的菌落，初起时，似为１小块水迹，需借助暗反射光才能看清。成熟的霉菌菌落多数有各种颜色的孢子形成，随种而异，极易判定。
４．１．２ 酵母菌菌落形态：在虎红琼脂平板上，多数为圆形凸起，边缘整齐，表面光滑湿润，呈不透明乳脂状，乳白色或粉红色。少数表面粗糙或皱褶，有的菌落周边呈细分枝状。位于琼脂内的菌落，可呈铁饼形、三角形及多角形。菌落外观与细菌菌落不易区别时，应挑取菌落，用水制片，置高倍显微镜下观察，其细胞个体比细菌大数倍，多为圆形或卵圆形，绝大多数为出芽繁殖。当平板内酵母菌菌落甚多时，常有酒香气。
在ＹＰＤ琼脂平板上的菌落与虎红平板上的形态相似，但稍大，多数为乳白色。
４．２ 菌落计数：一般在平板背面用肉眼直接点数，必要时用放大镜检查，以防遗漏。若有根霉或毛霉蔓延生长时，为避免影响其它霉菌和酵母菌计数，应及时将平板取出计数或从平板背面观察霉菌生长中心点或霉菌蔓延生长区域来计数。固体制剂仅计数霉菌菌落；液体制剂应计数霉菌菌落和酵母菌菌落的总数；含王浆或蜂蜜的合剂则应将虎红平板上的霉菌数加上ＹＰＤ平板上的酵母菌数为霉菌和酵母菌总数，计算各稀释级的平均平板菌落数。 ５．菌数报告规则
５．１ 选择菌落数在３０～１００之间的稀释级平板计数，以该稀释级的平均平板菌落数乘稀释倍数作为报告菌数。
５．２ 若邻近的２个稀释级平均平板菌落数均在３０～１００之间，计算级间比值。当比值≤２时，以两级菌落数的平均值为报告菌数；比值＞２时，按低稀释级平均菌落数乘稀释倍数为报告菌数。 ５．３ 各稀释级平均菌落数均不足３０时，以最低稀释级平均菌落数乘稀释倍数为报告菌数。 ６．菌数报告的书写
６．１ 固体制剂报告霉菌数；液体制剂及半固体制剂报告霉菌和酵母菌的总数。 ６．２ 菌数报告的书写参照细菌数测定。
６．３ 眼科用药各稀释级（含原液）均未生长菌落时，报告“未检出”。 大肠杆菌检验法
大肠杆菌为肠杆菌科埃希氏菌属细菌，是人和温血动物肠道内的常住菌，随粪便排出体外，可直接或间接污染药品及药品生产的各个环节。药品中检出大肠杆菌表明该样品已受到粪便污染，服用后有可能被粪便中存在的肠道致病菌或寄生虫卵等病原体感染。因此，大肠杆菌被列为粪便污染指示菌，是非规定灭菌口服药品的常规必检项目。 １．培养基、试剂
１．１ 普通肉汤培养基（附录三１）
１．２ 胆盐乳糖（ＢＬ）增菌液（附录三７）
１．３ 乳糖发酵管（附录三１３）或５％乳糖发酵管（附录三１４） １．４ 蛋白胨水培养基（附录三１０）
１．５ 磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基（附录三１１） １．６ 西蒙氏柠檬酸盐培养基（附录三１２） １．７ 伊红美蓝（ＥＭＢ）琼脂（附录三８） １．８ 麦康凯琼脂（附录三９） １．９ 柯凡克试剂（附录二４） １．１０ 甲基红指示剂（附录二４） １．１１ Ｖ－Ｐ试剂（附录二４） １．１２ 革兰氏染色液（附录二１） ２．检验程序
－－－－－ ｜供试品｜ －－－－－ ↓ －－－－－ ｜供试液｜ －－－－－ ↓
－－－－－－－－－－－ ｜ ＢＬ增菌液 ｜ －－－－－－－－－－－ ３６±１℃↓１８～２４小时 －－－－－－－－－－－ ｜ＥＭＢ或麦康凯琼脂｜ －－－－－－－－－－－ ３６±１℃↓１８～２４小时
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ｜ ｜ 疑似菌落生长 无菌落生长 ↓ ↓ －－－－－－－－－－ －－－－ ｜普通肉汤琼脂斜面｜ ｜报告｜ －－－－－－－－－－ －－－－ ３６±１℃ ↓ １８～２４小时
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
↓ ↓ ↓
－－－－－ －－－ －－－－－－－－－ ｜革 镜｜ ｜乳｜ ｜靛｜甲｜Ｖ｜柠｜ ｜兰 ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜｜｜檬｜ ｜氏 ｜ ｜ ｜ ｜基｜基｜Ｐ｜酸｜ ｜染 ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜试｜盐｜ ｜色 检｜ ｜糖｜ ｜质｜红｜验｜ ｜ －－－－－ －－－ －－－－－－－－－ ｜ ｜ ３６±１℃ ２４～４８小时｜ －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ↓ －－－－－ ｜报 告｜ －－－－－ ３．操作步骤
３．１ 增菌培养 取供试液（总则５）１０ｍｌ，加入备妥的１００ｍｌＢＬ增菌液内，置３６±１℃培养１８～２４小时。增菌液呈现混浊。液面可见或未见气泡都表明有菌生长，如未见明显混浊，可延长增菌培养时间至４８小时。
３．２ 分离培养 将上述增菌培养液轻微摇动，以接种环沾取１～２环划线接种于ＥＭＢ或麦康凯琼脂平板上。置３６±１℃培养１８～２４小时（必要时延长培养时间），观察菌落生长情况，大肠杆菌在ＥＭＢ琼脂平板上的典型菌落呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；在麦康凯琼脂平板上的典型菌落呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。由于药物影响或非典型菌的存在，大肠杆菌可出现非典型形态；在ＥＭＢ琼脂平板上呈现浅紫、粉紫、粉色，无明显暗色中心；在麦康凯琼脂平板上呈现微红色或粉色，菌落形态、质地也有改变。以上形态均应作为疑似菌落进行鉴定，切勿遗漏。
分离平板上无菌落或无疑似菌落生长，可作出未检出报告。
以接种针轻轻接触单个疑似菌落的中心，沾取培养物，每次应挑取２个或更多个疑似菌落，接种于普通肉汤琼脂斜面或三糖铁琼脂斜面上。置３６±１℃培养１８～２４小时，供革兰氏染色镜检及生化试验用。
在上述检验过程中若发现疑似的其它规定控制菌时，亦应继续鉴定。
３．３ 革兰氏染色镜检 将上述普通肉汤琼脂斜面培养物涂片，作革兰氏染色镜检。大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢短杆菌。由于菌龄等原因，菌体长短可有变化。 ３．４ 生化反应
３．４．１ 将上述斜面培养物接种于乳糖发酵管，置３６±１℃培养２４～４８小时，观察结果。大肠杆菌应发酵乳糖并产酸产气，或产酸不产气。产酸者，以酸性复红为指示剂的培养基显红色；以溴麝香草酚蓝为指示剂的培养基显黄色。产气者，倒管内有气泡。
为避免迟缓发酵乳糖造成假阴性，可选用５％乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌可于２４小
时内出现阳性反应。
３．４．２ ＩＭＶｉＣ试验
靛基质试验 将斜面培养物接种于蛋白胨水培养基中，置３６±１℃培养４８±２小时。沿管壁加入柯凡克试剂０．３～０．５ｍｌ，轻微摇动，观察液面颜色。阳性反应为玫瑰红色；阴性反应为试剂本色。 甲基红试验 将斜面培养物接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基中，置３６±１℃培养４８±２小时。于每ｍｌ培养液中加入甲基红指示剂１滴，立即观察结果，阳性反应培养液为鲜红色或桔红色；阴性反应呈黄色。
Ｖ－Ｐ试验 将斜面培养物接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基中，置３６±１℃培养４８±２小时。于每２ｍｌ培养液中加入Ｖ－Ｐ试剂甲液（６％ａ－萘酚酒精溶液）１ｍｌ，混匀，再加Ｖ－Ｐ试剂乙液（４０％ＫＯＨ）０．４ｍｌ，充分振摇，观察结果。阳性反应立刻或数分钟后出现红色。加试剂后４小时无红色反应时为阴性，如出现红色亦应判为阳性。
柠檬酸盐利用试验 将斜面培养物接种于西蒙氏柠檬酸盐斜面，置３６±１℃培养４８±２小时，观察结果。斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性反应；斜面无菌苔生长，培养基颜色无改变为阴性反应。若斜面有微量菌苔生长或颜色改变等可疑现象时，应将待检菌株重新分离、纯化后，再行试验。 大肠杆菌ＪＭＶｉＣ反应模式应为＋＋－－或－＋－－。对出现可疑反应的培养物，应将所分离的待检菌株于ＥＭＢ或麦康凯琼脂平板上重新划线分离后，再作生化试验证实。 表２： 大肠杆菌同有关细菌的ＩＭＶｉＣ鉴别及应用
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ｜ ｜ 靛基质 ｜ 甲基红 ｜Ｖ Ｐ｜ 柠檬酸盐 ｜ ｜－－－－－－－－－－－｜－－－－－｜－－－－－｜－－－｜－－－－－－｜ ｜ 典型大肠杆菌 ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜ ｜ 非典型大肠杆菌 ｜ － ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜ ｜－－－－－－－－－－－｜－－－－－｜－－－－－｜－－－｜－－－－－－｜ ｜ 典型中间型 ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ － ｜ ＋ ｜ ｜ 非典型中间型 ｜ － ｜ ＋ ｜ － ｜ ＋ ｜ ｜－－－－－－－－－－－｜－－－－－｜－－－－－｜－－－｜－－－－－－｜ ｜ 典型产气肠杆菌 ｜ － ｜ － ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ ｜ 非典型产气肠杆菌 ｜ ＋ ｜ － ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ４．结果报告 完全符合以下结果时，判定为检出大肠杆菌 （１）染色镜检是革兰氏阴性无芽孢杆菌； （２）乳糖发酵产酸产气，或产酸不产气； （３）ＩＭＶｉＣ试验反应为＋＋－－或－＋－－。 沙门氏菌检验法
沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属细菌，广泛分布于自然界，是人畜共患的肠道病原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒，危害人类健康。沙门氏菌可通过人类、畜、禽的粪便或带菌者直接或间接污染
药品，生产环境及生产的各个环节，特别是以动物、脏器为原料的药品污染机率较高。受到污染的药品，不仅直接影响服用者的安全，并可造成沙门氏菌的传播和流行。故对某些药品必须检查沙门氏菌。 药品中污染的沙门氏菌常在生产过程中受到损伤而处于濒死状态，故检验时须先在无选择性的增菌液中使其复苏，然后再进行选择性增菌。 １．培养基、试剂
１．１ 普通肉汤培养基（附录三１） １．２ 四硫磺酸盐增菌液（附录三１５） １．３ 胆盐硫乳（ＤＨＬ）琼脂（附录三１７）
１．４ 沙门氏菌属志贺氏菌属（Ｓ．Ｓ）琼脂（附录三１８） １．５ ＥＭＢ琼脂（附录三８） １．６ 麦康凯琼脂（附录三９）
１．７ 三糖铁（ＴＳＩ）琼脂（附录三１６） １．８ 蛋白胨水培养基（附录三１０） １．９ 尿素琼脂培养基（附录三１９） １．１０ 氰化钾培养基（附录三２０） １．１１ 赖氨酸脱羧酶培养基（附录三２１） １．１２ 糖发酵培养基（附录三１３） １．１３ 半固体肉汤琼脂（附录三３） １．１４ 沙门氏菌属Ａ－Ｆ“０”多价血清 １．１５ 革兰氏染色液（附录二１） １．１６ 柯凡克试剂（附录二４） ２．检验程序 @@ ３．操作步骤
３．１ 增菌培养 取供试液（总则５）１０ｍｌ，加入备妥的１００ｍｌ普通肉汤内，混匀。置３６±１℃培养１８～２４小时。轻微摇动培养液，取１ｍｌ加入含１０ｍｌ四硫磺酸盐增菌液的试管内，再置３６±１℃培养２４±２小时。如有菌生长，增菌培养液变混。
－－－－－ ｜供试品｜ －－－－－ ↓ －－－－－ ｜供试液｜ －－－－－ ↓
－－－－－－－－－－－ ｜ 营养肉汤 ｜