总RNA的提取（Trizol法提取）
在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1. 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放臵5分钟； 3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放臵2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；
4. 取上层水相臵于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放臵10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟； 5. 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清； 6. 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
PCR
实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。
1. 按下列组成在PCR反应管中调制反应液：
TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方 Reagent 10X PCR buffer （Mg2+ free） Quantity, for 50μl of reaction mixture 5 μl 1
如TaKaRa TaqTM加3 μl MgCl2（25mM） 2.5mM dNTP mix 10μM Primer 上游 10μM Primer下游 Template DNA Taq或EXTaqDNA Polymerase Sterile deionized water Total 如TaKaRa EXTaqTM加4 μl 4 μl 1 μl 1 μl 1 μl 0.25 μl Up to 50μl 50 μl /Sample PyrobestTM DNA Polymerase的配方
Reagent 10X Pyrobest buffer 2.5mM dNTP mix 10μM Primer上游 10μM Primer 下游 Template DNA PyrobestTM DNA Polymerase Sterile deionized water Total
① 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50μl以节约试剂； ② 将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；
③ 如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 ~50μl 的矿物油
防止样品在PCR的过程中蒸发；
Quantity, for 50μl of reaction mixture 5μl 4μl 1μl 1μl 1μl 0.25μl Up to 50μl 50μl /Sample 2
2. 按以下程序进行PCR扩增。
PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。
Step Temperature, °C Time, min 起始变性 变性 退火 94~95 94~95 37-70 1-3 0.5-2 0.5-2 根据扩增产物延伸 最终延伸
70-75 的大小 70-75 10 Number of cycles 1 Note 退火温度比理论退火温度大概低5°C，再25-35 根据反应结果优化 每分钟延伸1000bp 1 反应结束后，抽取扩增样品5μl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
RT-PCR
Protocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)
1. 按下列组成在PCR反应管中调制反应液
Quantity, for 50μl of reaction mixture 5μl 10μl 3
Reagent 10×One Step RNA PCR Buffer 25 mM MgCl2
10 mM dNTP mix RNase Inhibitor (40 U/μl) AMV-Optimized Taq AMV RTase XL (5 U/μl) 上游特异Primer (20 μM) 下游特异Primer (20 μM) 实验样品RNA（≤1 μg Total RNA） RNase Free dH2O Total 5μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 24μl 50μl /Sample 1. 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50μl以节约试剂； 2. 将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；
3. 如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 ~50μl 的矿物油防
止样品在PCR的过程中蒸发；
2． 按以下条件进行反应
Number Step Temperature, °C Time, min of cycles 逆转录 逆转录酶失活 变性 94 94 2 0.5 1 50 30 1 Note 退火温度比理论退火温退火 37-65 0.5 25-35 根据扩增产度大概低5°C，再根据反应结果优化 Taq酶每分钟延伸1000bp 延伸 72 物的大小 4
最终延伸 72 10 1 反应结束后，抽取扩增样品5μl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
琼脂糖核酸电泳
1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架
好梳子；
2. 根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确
称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30 ml）；
3. 放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分
混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；
4. 室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内； 5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气
泡，应设法除去；
6. 在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪
将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；
7. 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠
近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可； 8. 根据指示剂泳动的位臵，判断是否终止电泳；
9. 电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位臵，并与核酸分子
量标准Marker比较被扩增产物的大小。
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5%
5
线形DNA的最佳分辨范围（bp） 1,000～30,000 800～12,000 500～10,000 400～7,000 200～3,000