9． 蛋白检测(显色法或发光法，按相应试剂说明操作)。 注意事项：
1．操作中戴手套，不要用手触膜。
2．PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。
3．如检测小于20kD的蛋白应用0.2μm的膜，并可省略转移时的平衡步骤。 4．某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱，此时可用1.0% BSA代替Tween-20。 5．关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩盖
抗体结合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的内源性交叉反应性。
6．如用0. 1% Tween 20、0.02% NaN3 in PBS or TBS作封闭剂和抗体稀释液，抗
体检测后可进行蛋白染色。
7．如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。
PVDF膜上蛋白的可逆染色 Western杂交时，为确认蛋白是否转至PVDF膜上，可用下列方法对膜上蛋白进行可逆性染色。
1. 氨基黑染色
染液：0.5% Amido Black (w/v), 25% isopropanol (v/v) and 10% acetic acid. 染色：将PVDF膜臵于染液中染色数钟，ddH2O 脱色。 2. 考马氏亮蓝染色
染液：0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v) and 50% methanol (v/v) 脱色液：40% methanol (v/v) with 10% acetic acid (v/v)
染色：将PVDF膜臵于染液中染色15 min.，脱色液脱色。
3．丽春红染色Ponceau S
染液：0.2% w/v Ponceau S in TCA (3% v/v) 染色：将PVDF膜臵于染液中染色5min 脱色：ddH2O 脱色 三、银染
PAGE胶上蛋白质的银染方法有数百种，其原理相似，具体步骤各不相同。银染为蛋白质的非特异性染色，呈“爆炸性”反应模式，用于蛋白定量时准确性差，但其敏感度高、简便易行，仍被广泛应用。下面列举的这三种方法为常用的双向电泳凝胶染色法，可与质谱兼容。其中方法1敏感性最高，方法3背景最低、对比度好。
1. Blam silver staining protocol (Modified) 程序 溶液 时间 36
固定 漂洗 致敏 漂洗 染色 漂洗 显色 漂洗 中止 漂洗 贮存 程序 固定 漂洗 致敏 漂洗 染色 漂洗 显色 中止 贮存 程序 固定 漂洗
40%ETOH 10%HAC 30%ETOH 0.02%Na2S2O3 H2O 0.1%AgO3(预冷) H2O H2O(更换盘子) 3%Na2CO3 0.05%甲醛 H2O 5%Hac H2O 1%Hac,4℃ 溶液 50%MeOH 5%HAc H2O 0.02%Na2S2O3 H2O 0.1AgNO3 (预冷) H2O 2%Na2CO3 0.04%甲醛 5% HAc 1% HAc，4℃ 溶液 50%MeOH 12%HAc 0.05%甲醛 35%EtOH 1小时 2×20min 1min 3×20Secs 4℃，20mins 3×20Secs 1min 20Secs 3×10min 时间 20min 2hr或过夜 1min 2×1min 20min 2×1min 时间 2hr或过夜 3×20mins 37
2. EMBL Silver Staining Protocol 3. Vorum Silver Staining Protocol 致敏 漂洗 染色 漂洗 显色 中止 贮存 注意事项：
0.02%Na2S2O3 H2O 0.2AgNO3 0.076%甲醛 H2O 6% Na2CO3 0.05%甲醛 0.0004% Na2S2O3 50%MeOH 12%HAc 1%HAc，4℃ 2min 3×5mins 20min 3×5mins 5mins 1. 应严格按照操作步骤进行； 2. 显色前最好更换新染色盘；
3. 显色时变为黄色或棕色后立即弃去，更换新鲜显色液，一般来说染
一块胶应配制500ml染液。更换2-3次； 4. 市售甲醛的浓度为37%；
5. 三种方法均与质谱兼容，Blum法敏感性高，但背景呈淡黄色，EMBL
法次之但背景较低，染色点较黑。Vorum相对不敏感，但背景清晰，信噪比高。
人肿瘤抗原的识别与鉴定
－免疫沉淀实验流程
一、裂解细胞
1． 收集细胞。将培养瓶臵于冰上，倒掉培养基，用PBS或生理盐水漂洗两
次，留适量液体于瓶内，然后用特制的细胞刮棒朝一个方向刮取细胞。将细胞悬液转移到离心管，离心取沉淀，-800C保存。（收集细胞要迅速，低温下进行，以减弱蛋白酶的作用）
2． 裂解细胞。采用RIPA裂解体系，使用前40C预冷，按107个细胞加入
1.0ml裂解液，吹打混匀，加入适量的蛋白酶抑制剂（如cocktail），冰上放臵3~5分钟。
3． 超声处理裂解液。使用探针型超声进行多次适当频率的短促冲击，10~20
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秒/次，重复3次，中间间隔10~20秒，冰浴下进行。
4． 15,000rpm，40C离心15min，吸取上清液于另一Ep管中，臵冰上。上
清液用于下一步的预处理。
二、裂解物的预处理
使用正常人的血清对裂解物进行预处理。
1、按1ml裂解物加2μl对照血清的比例加入正常人血清。 2、室温孵育2~3小时，缓慢摇动。 三、免疫复合物的纯化
1) 用Dynabeads proteinA进行免疫复合物的纯化。
2) 将Dynabeads proteinA 振荡混匀，吸取100μl磁珠于Ep管中，臵于磁铁架
（Dynal MPC）上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。
3) 加500μl 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 )至Ep管，轻柔搓动管子约2~3min，将
Ep管臵于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。 4) 重复2步骤两次。
5) 清洗完磁珠后，加500μl预处理后的裂解物，反复摇动管子，室温下反应
10~20min。
6) 将Ep管臵于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，将上清转移至另一Ep管中。 7) 用RIPA裂解液清洗磁珠3次。
8) 洗脱抗原-抗体复合物。加0.1M citrate (pH3.1) 30μl于Ep管中，轻柔搓动管
子约2~3min，将Ep管臵于磁铁架上，吸取上清于一Ep管。
9) 重复步骤7，将上清收集于同一个Ep管洗脱样品总体积为60μl，作对照用。 10) 磁珠用 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 ) 清洗三次后备用。
11) 在步骤5留取的上清中加入病人血清（1ml加2μl血清），缓慢摇动，室温孵
育2~3h。
12) 将Ep管臵于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。
13) 重复步骤6~8。共收集到两份样品,对照与病人的纯化免疫复合物各60μl。 14) 磁珠用 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 ) 清洗三次后加入柱储液100μl,40C保存。 15) 在样品中加入2×SDS上样缓冲液并用1M NaOH调节pH至使溴酚蓝呈蓝色。 四、1D SDS-PAGE
用免疫沉淀后的样品可直接进行一维凝胶电泳，或者对磁珠上的蛋白A或蛋白G进行耦联剂修饰，洗脱后的样品可进行Western Blot。
RIPA裂解液：150mmol/L NaCl；1.0%NP-40；0.5%脱氧胆酸钠；0.1%SDS；50mmol/L Tris，（pH 8.0）
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蛋白质组实验流程 双向电泳的样品的制备
样品制备原则
样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响2-DE结果好坏。目前并没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。
根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，如CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂以及核酸酶。
样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条，这样都会造成2-DE的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。
核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。
因此，样品制备方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。目前有很多方法适于2-DE，如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细胞组份或细胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白（如磷酸化蛋白、采用亲合纯化凝集素结合蛋白等）。 一、细胞样品
1. 细胞培养，加药与处理。
2. 胰酶消化贴壁细胞，PBS漂洗3次(1500ｇ，5min)，弃上清, 再次离心，去
尽残液（非常重要！）。如要比较细胞膜蛋白组的差别，最好用细胞刮收获细胞。如用10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替PBS，可有效降低样品的盐浓度。
加入5倍体积裂解液，混匀（或将1×106细胞悬于60～100μl裂解液中）。
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