4. ELISA或Western blot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的
表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。
重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量
按Qiagen公司的操作手册进行，具体步骤如下。 一、重组蛋白质的诱导表达
1. 挑取转化有质粒的单菌落，接种于3ml 选择性LB液体培养基中，37 oC，250 rpm/min振摇培养过夜。
2. 次日将培养过夜的菌液500 μl再接种于10 ml（1:20）选择性LB液体培养基中，37 oC，250 rpm/min振摇培养至光密度（OD600=0.6）时，取1 ml样本作为诱导前标本，10000g离心1 min收集菌体沉淀，－20 oC冻存备用。 3. 加入1 mol/L IPTG于菌液中，使IPTG终浓度为1 mM，37 oC，250 rpm/min振摇培养4～5小时。取1 ml样本作为诱导后标本，同上法收集菌体沉淀，－20 oC冻存备用。
4. 将诱导前后菌体沉淀用20 ~ 40 μl PBS（pH= 8.0）重悬，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸加热5 min，SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离，考马斯亮蓝染色3小时后，脱色观察结果。
5. 选取诱导成功的细菌克隆，扩大诱导规模，收集菌体沉淀，于－20 oC保存，准备做下一步分析及纯化。 二、重组蛋白质的分离纯化 重组蛋白质的可溶性鉴定
1. 将按上法诱导培养后收集的菌体重悬于裂解液1 (Lysis buffer under native conditions )中，然后在－80 oC低温冰箱中放臵10 min。 2. 冰中解冻。
3. 在冰浴上用超声破碎仪破菌6次，每次10 sec，间歇10 sec，电压200-300 V。 4. 10000g，4oC，离心20 min，取上清（为溶液A），－20 oC保存；另将沉淀用同样裂解液1溶解（为溶液B），同样－20 oC保存，供后继分析使用。 5. 将上述A、B溶液和诱导前后的细菌进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，比较分析重组蛋白质的溶解性。如果诱导表达的蛋白质位于A溶液中，则为可溶性蛋白；如果是在B溶液中，则为非可溶蛋白。 重组蛋白质为非可溶性蛋白（变性条件下）的分离纯化
1. 将菌体沉淀溶于适量裂解液2（Lysis buffer under denaturing conditions）中，室温下搅拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。 2. 10000g，4 oC，离心30 min，收集上清液。
3. 将Ni-NTA Agarose充填柱子，并连接于Pharmarcia低压液相层析系统，用5
11
倍柱体积的裂解液2平衡Ni-NTA Agarose，调节A280值至零线。
4. 将适量上清液上样到Ni-NTA Agarose柱子中，并用lysis buffer冲洗至A280
值低于0.01。
5. 分别用5～10倍柱体积的清洗液1 和清洗液2（Wash buffer 1 and 2）清洗柱子，直至A280值低于0.01。
6. 用洗脱液（Elution buffer）洗脱重组蛋白质，在A280值监测下，收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液。 三、重组蛋白质的复性、冻干和定量
纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析，最终用0.01×PBS透析，透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。以牛血清白蛋白(BSA)为标准，采用BIO-RAD公司蛋白质定量试剂(protein assay)比色测定蛋白质的含量。
肿瘤细胞体外传代培养及保种
一. 细胞复苏与培养
将液氮或-80oC保存的肿瘤细胞于37oC 水浴, 快速溶化, 用8.0ml培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液, 于1500转/分, 离心3分钟。弃上清, 再吸取8.0ml培养基质混匀细胞沉淀, 再1500转/分, 离心3分钟, 弃上清, 细胞沉淀用1.0ml培养基混匀, 备用。 另取一个75cm2方瓶, 加入14.0ml培养基质, 将上述制备的含肿瘤细胞悬液(1.0ml)加入此方瓶中, 于37oC，5%CO2孵育箱中培养。
若此肿瘤细胞悬浮生长, 大约3－4 天细胞基质会变黄, 5.0ml细胞悬液可传代一个方瓶培养, 可用3－4个方瓶培养, 一个方瓶中呈对数生长的肿瘤细胞可达1—1.5×107 个, 根据试验所需, 可决定传代的次数。 若此肿瘤细胞呈贴壁生长, 经过3—4天, 肿瘤细胞生长至80%—95% 单层时, 弃上清, 用0.5mM 的EDTA(难消化的肿瘤细胞用0.25%胰酶1.0ml), 处理肿瘤细胞大约 3—5分钟, 用倒臵显微镜观察，当90% 的肿瘤细胞变圆时, 即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到15ml离心管中, 于1500转/分下，离心3分钟, 弃上清, 加少许培养基混匀, 可传代3个75cm2方瓶扩大培养。 二. 细胞冻存
将对数生长的肿瘤细胞用1个75cm2 方瓶按上述方法收集, 于1500转/分 离心3分钟,弃上清, 用保种液(含10% DMSO的小牛血清)3.0ml混匀, 分别加入到2—3只保种管中, 写上肿瘤细胞名称, 时间, 保种者姓名, 放-80o C 保存, 次日将它们转移到液氮中保存(注: -80o C下可保存细胞半年至一年, 液氮可保存细
12
胞5—10年, 甚至更长的时间)。以上所有物品均需经过高温灭菌( 121oC, 30分钟)，培养基质则经过过滤(0.22uM)除菌, 所有操作均必须遵守无菌操作技术, 避免细菌、真菌、病原体、衣原体等污染。
肿瘤动物模型的建立
将对数生长的肿瘤细胞收集, 用无血清基质10.0ml, 于1500转/分, 离心3min, 连续洗3次, 最后用无血清基质混匀, 用血球计数器计算肿瘤细胞数量(平均5个中方格的细胞计数×104 即是肿瘤数/毫升)。 计算完肿瘤细胞总数, 再将肿瘤细胞密度调至4×106 个/ml, 每只小鼠腋下接种50ul(即2×105个肿瘤细胞), 2周左右可扪及肿瘤小节结。一般选取6—8周的小鼠，不同的肿瘤细胞接种的数量和动物不一样, 比如LL/2, B16, Hep? 可接种C57和BALB/C 小鼠, NS-1, EL-4, C26, Meth A可接种BALB/C 小鼠, H22接种昆明鼠。从肿瘤接种后可扪及小结节开始, 每3天用游标卡尺量肿瘤纵横大小(单位: mm), 至少连续一个月时间。注意要设计不同的实验组和对照组, 每组动物数一般为5—10只, 一般接种肿瘤6—8周后，小鼠的肿瘤可生长至直径为15—20mm (即小鼠会濒临死亡)时, 可眼球取血，分离血清并保存血清, 处死小鼠, 取肿瘤组织照相, 取部分肿瘤组织作冰冻组织切片(或-80℃ 保存), 作相应的免疫组织化学染色, 取部分肿瘤组织用3%中性的甲醛固定, 石腊包埋, 作常规HE染色.
小鼠尾静脉注射方法
在靠近实验台边缘处, 用大培养皿扣住小鼠, 左手抓住小鼠尾巴, 用酒精棉球擦尾巴, 可见到两侧静脉; 注射前应确认针管内无气泡, 注射时由尾尖开始, 顺向刺入。失败后再逐渐移向根部重刺, 若准确刺入静脉内, 推进时无阻力, 一般可注入0.1—0.5ml。
肿瘤蛋白疫苗预防性动物实验
一般肿瘤蛋白疫苗首次免疫剂量10ug/只小鼠, 与相应佐剂混匀, 在背部皮下注射, 第2次免疫间隔2周, 同样加佐剂在皮下注射； 第3次免疫间隔2周, 同样加佐剂在皮下注射；第3次免疫后2周, 用ELISA检测其血清效价，当效价达到要求时；在接种肿瘤细胞前3天,于腹腔或尾静脉加强注射20ug /只。
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养
13
1. 将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。 （注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）
2. 用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。
3. 用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。
4. 消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。 5. 将收集液离心（2000转/分）3分钟。
6. 倒去上清，加入10ml M199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。
（注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。）
7. 培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10 ml新鲜的 M199培养基。 8. 以后每2天换一次培养基（每次换掉2/3的培养基）。 9. 一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。
10. 倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液（0.25%胰酶+0.1íTA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。
11. 用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50 ml无菌离心管中，2000转/分，离心3分钟。
12. 倒掉上清,加入10ml新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4瓶.以后照此传代培养. 13. 一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果最好。
实验动物免疫方案
1、抗原: 蛋白质、多肽、细胞器、细胞、组织等。
2、免疫方式：皮下注射、腹腔注射、静脉注射、肌肉注射等。 3、不同动物免疫所需抗原量（以蛋白免疫为例）
>18-20kDa <18-20kDa
14
动物 抗原量 最佳抗原量 抗原量 最佳抗原量 兔子 20-200 100 50-400 200 小鼠 2-40 15 4-60 40 大鼠 10-50 30 20-150 50 绵羊 100-1000 200 200-1000 400 母鸡 20-200 100 50-400 200 单位：微克
4、免疫方案（以免疫兔子为例）：
天数 0 14 28 38 56 66 87 注射 x x x x
采血 2ml 2ml 2+20ml 2+50-70ml 5、注意：
? 第一次免疫用完全佐剂与免疫原混合，以后加强免疫用不完全佐剂与免疫原
混合，采取多点，时间间隔式免疫法。
? 如果用细胞免疫兔子，那么每次免疫所需细胞量为2-3 x 107 cells。 ? 在连续免疫完三次后，需要少量取血进行ELISA检测，检测所免疫动物的抗
体滴度，一般滴度能达到1:10,000-50,000。在处死所免疫的动物前一周应加强一次免疫。
? 如果用小鼠免疫，可以尾静脉小量采血（大约50μl），最后取眼球大量采血
（大约500-1000μl）；如果用兔子免疫，可以耳缘静脉小量取血(大约2mL)，最后心脏大量取血(50-100mL)
? 按血清制备的标准方法将血清分离，并且分装成小份，储藏在-80oC。
血清制备
1. 取血后，37oC下，让血液凝固1到2小时（不加抗凝剂）； 2. 4oC冰箱过夜（让血块固缩）；
3. 当血清自然析出后， 4oC，3000转/分，离心10分钟，分离血清，弃去
不溶物；
4. 将血清移至一干净试管，并分装成小份，储藏在-80oC。
ELISA
一、包被抗原
1. 用50mM的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原浓度为10-20 μg/ml，
15