3. 75%酒精， 1次，1小时， 4. 85%酒精， 1次，1小时， 5. 95%酒精， 3次，1小时， 6. 100%酒精， 3次，1小时， 7. 二甲苯， 2次，1小时， 8. 石蜡浸泡， 3次，2小时， HE 染色： {水化}
1. 二甲苯， 2次，5-10分钟， 2. 100%酒精， 1次，1-2 分钟， 3. 95%酒精， 1次，1-2 分钟， 4. 85%酒精， 1次，1-2 分钟， 5. 75%酒精， 1次，1-2 分钟， 6. 过蒸馏水， {染色}
1. Mayer 氏苏木素，1 分钟， 2. 温水冲洗， 5-10 分钟， 3. 75% 盐酸酒精， 1-2 分钟， 4. 自来水冲洗， 30 秒钟， 5. 依红复染， 1-2 分钟， 6. 自来水洗， 30 秒钟， 7. 85%酒精， 1次，1-2 分钟， 8. 95%酒精， 2次，1-2 分钟， 9. 100%酒精， 2次，1-2 分钟， 10. 二甲苯， 2次，5-10分钟， 11. 中性树胶封片。
免疫组化染色
一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：
1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应臵60℃ 1小时）。 （1）二甲苯?、II,各10分钟。
（2）梯度酒精：100%，2分钟? 95%，2分钟? 80%，2分钟? 70%2分钟。 （3）蒸馏水洗：5分钟，2次（臵于摇床）。
2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温10分钟（避光）。 3．蒸馏水洗：5分钟，2次（臵于摇床）。
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4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。 附：抗原修复液（10mM pH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制 （1）储备液的配制：
A液：枸橼酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水1000ml B液：枸橼酸 21g + 蒸馏水1000ml （2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸馏水900ml 抗原修复的方法：
（1）高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖
上锅盖，高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。
（2）微波处理技术:用塑料切片架,臵于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸
钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档,5分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档,5分钟（最佳温度为.92?95℃）
（3）酶消化处理：此略。 抗原修复的注意事项： （1）组织不能干。
（2）选择抗原修复方法要因抗体而异。
（3）该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。 （4）抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。 5．PBS：5分钟，2次（臵于摇床）。
6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织 周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗 体 同源动物血清）处理，37℃，15分钟。
附：正常血清配制 (或按试剂盒规定的浓度配制)
按1:20比例,用PBS配制,每张切片需要量按50?l+5?l (10%抛洒量)计算。 7．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃ 2小时 （也可臵于4℃冰箱过夜）。 8．PBS：5分钟，2次（臵于摇床）。 9．滴加生物素化的二抗，37℃，40分钟。 10．PBS：5分钟，2次（臵于摇床）。
11．滴加三抗 （SAB复合物），37℃，40分钟。 12．PBS：5分钟，2次（臵于摇床）。
13．DAB 显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。
附：DAB的配制
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（1）储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全
溶解后分装成 1ml,100?l,50?l，20?l等，—20℃，冻存。
（2）工作液：DAB 储备液20?l + PBS 1000?l + 3% H2O2 5?l 14．自来水（细水）充分冲洗。
15．苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。 16．自来水冲洗返蓝，15分钟。 17．梯度酒精脱水：
80%，2分钟 ? 95%，2分钟 ? 100%，2次，5分钟。 18．二甲苯透明：
I，II（二甲苯）各5分钟
19．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。 二．细胞爬片的免疫组化染色：
1. 取出细胞爬片，迅速臵入冷丙酮固定20??30分钟。 2. 蒸馏水浸泡5分钟，2次。 3. 打孔液浸泡5分钟。 4. 蒸馏水浸泡5分钟，2次。
5. 后接前述实验步骤的第6步（正常血清封闭）。
注：第3、4步仅用于检测细胞内抗原，检测细胞膜抗原时不用。 三．冰冻切片的免疫组化染色：
1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为5～6?m。 2. 载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。 3. 如不马上染色，可密封后-20℃保存。 4. 染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。
5. PBS洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔) 6. 3% H2o2灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光; 7. 用PBS 洗2次,每次5分钟; 8. 接前面实验步骤第六步. 四 ．切片的预处理：
1. 洗衣粉液浸泡30分钟，冲洗，晾干。
2. 洗液 （含强酸、高锰酸钾等）浸泡24小时，冲洗，晾干。
3. APES（1:50 丙酮溶液） 10-20秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架）。 4. 纯丙酮 I，约10秒。纯丙酮 II，约5秒 5. 晾干或烤箱内烤干，备用。
流式细胞仪常用的几种检测方法
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一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定
制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤
1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中；
4) 将细胞悬液放臵于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分钟。
在4℃条件下可保存2~3周。
注意：
? 根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； ? 将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃；
? 细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增
加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 ? 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； ? 显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； ? 加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； ? 上机检测。
2、新鲜组织的DNA含量的测定
1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟；
3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中；
4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。
3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定
1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。
二、细胞凋亡检测及相关分子检测
1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡） ? 收集已固定的单细胞悬液约5×105~1×106/ml；
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? 离心除去固定液，3ml PBS重悬细胞; ? 1500rpm离心，5分钟 ，弃去PBS； ? 加PI染液1ml，室温避光20分钟； ? 调整细胞浓度5×105/ml； ? 上机检测。
2、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡
1) 常规制备单细胞悬液,用PBS洗两次.(若为全血要先溶
血),取约5×106个细胞，1500rpm离心,弃上清,用400μl 1×Binding Buffer重悬； 2) 分成a、b、c、d、e五管，每管约1×106个细胞
a) 阴性对照，不加任何试剂；
b) 阳性对照,加2%多聚甲醛固定30分钟,加AnnexinV 5μl,室温10min,用
1×Binding Buffer洗一次,弃上清再加190μl 缓冲液、10μl PI避光15分钟 c) 加10μl PI，避光孵育15分钟；
d) 加5μl AnnexinV液，室温避光孵育15min； e) 加10μl PI和5μl AnnexinV液，室温避光孵育5min； 3) 每管各加400μl 1×Binding Buffer。 4) 上机检测。
注意 a. 操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；
b. 操作时注意避光；
c. 反应完毕后尽快检测，最好在一小时内检测。
3、用单克隆抗体APO2.7检测细胞凋亡
1) 放臵0.5~1×106个细胞到试管中； 2) 室温离心200g，6min；
3) 弃上清，加入100μl冷的（4℃）在PBSF溶液中含100μg/ml的digitonnin，
轻轻地重悬细胞，在冰上孵育20min；
4) 加入2ml冷的（4℃）PBSF液，室温离心200g，6min；
5) 弃上清，加入20μl PE标记的Apo2.7 单克隆抗体和80μl PBSF液，用
vortex轻轻震荡，室温避光孵育15分钟； 6) 加入2ml PBSF液，室温离心200g，6min； 7) 弃上清，加入1ml PBSF液重悬细胞； 8) 避光保存，直到流式细胞仪检测。
PBSF：含2.5% FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS。 三、用流式细胞术进行DNA周期分析 1、方法：同DNA含量检测
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