加100 μl/孔到96孔酶标板，4 oC放臵过夜。
2. 第二天弃去包被液后，用PBST洗涤3次，每孔加入150 μl 1％ BSA 37 oC封闭1小时。
3. PBST洗涤3次后，每孔加入100 μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 oC孵育2小时。
4. PBST洗涤5次后，加入100μl稀释后的HRP标记的二抗，37 oC孵育1小时。 5. PBST洗涤5次后，显色剂显色20 min后，酶标仪上读取A405吸收值。 二、包被细胞
1. 在96孔培养板上接种细胞数为1 x 104 cells/well，37℃过夜培养。 2. 第二天用PBS洗涤培养板2-3次。
3. 加入125 μl/well 10% Formalin（1:10稀释）, 室温下固定15 min。 4. 用ddH2O洗涤培养板3次，并晾干，储藏在2-8oC备用。 5. 用PBST洗涤3次，每孔加入150 μl 1％ BSA 37 oC封闭1小时。 6. PBST洗涤3次后，每孔加入100 μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 oC孵育2小时。
7. PBST洗涤5次后，加入100 μl稀释后的HRP标记的二抗,37 oC孵育1小时。 8. PBST洗涤5次后，显色剂显色20 min后，酶标仪上读取A405吸收值。 50mM的碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,
Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。 ABTS作为底物进行显色反应(10ml)：
? 0.2M Na2HPO4 2.4ml ? 0.1M 柠檬酸2.6ml ? ddH2O 5ml ? ABTS 5mg
? H2O2(30%) 4 ul（用前加入）
注 意：
? 一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。
? 不同的显色系统对应不同的光吸收值。
血清学筛选克隆新抗原/新基因
一、E.coli/ phage 裂解液预吸附血清
1. 将E.coli /phage lysate以1:10-20稀释在TBST溶液中。
2. 将4张82mm的nitrocellulose membranes（NC）浸入稀释后的E.coli/ phage
16
lysate中，室温下水平摇动30分钟，取出NC并使膜沥干。 3. 用50ml TBST溶液洗膜3次，每次10分钟。 4. 用滤纸轻轻吸去膜上的液体。
5. 将膜放入50ml封闭液中，室温下水平摇动最少30分钟。
6. 将膜从封闭液中取出，用50ml TBST溶液洗膜3次，每次10分钟。 7. 将血清按1:5稀释在TBST溶液中，将一张膜放入溶液中，37℃下轻轻水平
摇动10分钟。
8. 从血清稀释液中取出膜并丢弃,加入另外一张新膜,37℃下轻水平摇10分钟. 9. 重复步骤8，直至所有4张膜都处理完。
10. 除去最后一张膜，收集血清（primary antibody），分装成小份储存于-80℃冰
箱中待用。 注意：
? 该步处理过程是为了去除血清中能与细菌和噬菌体裂解蛋白进行免疫反
应的抗体，这样可以减少假阳性率；
? 一抗不能反复冻融，化冻后不要再次冰冻，可放于4℃作短暂保存； ? 可以是病人血清，也可以是免疫血清，如果是病人血清，则需要至少10
个病人血清进行混合；
二、噬菌体筛选
1. 准备NZY agar plates（至少用前24小时倒好），用前在37℃培养箱中烘烤1-2
小时以去除水滴。
2. 将过夜培养的XL1-blue MRF’细菌2000转/分，离心10分钟，将细菌溶解在
10mM MgSO4中，调整细菌浓度为OD600=0.5。 3. 融化NZY top，并将NZY top放在50℃水浴中。
4. 将适量的XL1-blue MRF’细菌溶液与一定稀释度的phage文库混合，37℃下
共同作用15分钟。
? 直径90mm平板：200μl XL1-blue 细菌+适量的phage文库 ? 直径150mm平板：600μl XL1-blue 细菌+适量的phag文库 （噬菌斑数量一般保持在3000pfu/90mm; 12000pfu/150mm）
5. 将步骤4中的混合液与NZY top溶液混合（200μl混合液+3-4mlNZY top溶
17
液；600μl混合液+8-10 ml NZY top溶液），倒入到NZY agar plates中，室温下放10分钟左右，然后倒臵放于37℃下培养。
6. 当噬菌斑刚好可看到时（大约5-8小时），从培养箱中拿出平板。 7. 将NC放入10mM IPTG溶液中完全浸湿，在空中使膜沥干，并做好3个不
对称的标记。
8. 将IPTG处理好的NC贴在平板上，不留气泡，然后倒臵放于37℃下培养。 9. 过夜培养后，第二天早上取出平板，用镊子将膜轻轻掀起，注意不要将培养
基粘在膜上。
10. 将膜放于50ml TBST溶液中，水平脱色摇床上震荡洗膜3次，每次10分钟。 11. 将膜放入50ml封闭液中，水平摇动，封闭4-6小时。 12. 在封闭液中加入适当滴度的一抗，水平摇动处理过夜。 13. 将膜放于50ml TBST溶液中，洗膜3次，每次10分钟。
14. 在封闭液中加入适当滴度的二抗（各个公司的二抗使用滴度不同），室温水
平摇动1-2小时。
15. 将膜放于50ml TBST溶液中，洗膜3次，每次10分钟，最后用50ml TBS
溶液洗膜15-20分钟，取出膜空气中沥干。
16. 将膜放入BCIP-NBT显色液中避光显色，水平摇动直到阳性斑点可见为止。 17. 从显色液中取出膜放在TBS溶液中，空气中使膜干燥。
18. 根据所做的标记,将膜与平板对齐,将平板上对应的阳性克隆区域的培养基挖
出放入500μl SM buffer中,并加入25 ml chloroform,4℃贮存（最多可贮6月）。 19. 第一轮筛选得到阳性克隆需要进行第二轮筛选以去除假阳性并获得阳性单
克隆噬菌体。过程如第一轮筛选，只不过用直径90mm平板；具体过程见步骤4，这时所加入的噬菌体溶液是第一轮筛选得到的噬菌体上清（见步骤18），在用前要滴定好噬菌体的滴度，噬菌斑的数量以可区分出单个克隆，同时密度不能太稀为标准（一般100-200 pfu/90mm）。
20. 按第一轮相似的过程进行实验，最后显色，确定真正的阳性克隆，并将阳性
单克隆所在的培养基挖出放入500μl SM buffer中，并加入25 ml chloroform，4℃贮存（最多可贮存6月）。 注意：
18
? 封闭液一般可用：5%的脱脂牛奶或1%的BSA溶解在TBST溶液中。 ? 第一轮筛选用150mm的平板；第二轮筛选用 90mm的平板，一般需要筛选
至少1 x 106 pfu。
? 认真做好三个不对称的标记，特别在第二轮挑选阳性克隆时要仔细将膜与平
板吻合好，不能挑错。 三、单克隆剪切
1. 取第二轮筛选得到的阳性克隆贮存液上清。
2. 将过夜培养的XL1-blue MRF’细菌2000转/分离心10分钟，将细菌溶解在
10mM MgSO4中，调整细菌溶度到OD600=1.0。
3. 在一个EP管中加入：200μl XL1-blue MRF’细菌+250ul phage stock（步骤1）
+1 ul ExAssist helper phage。
4. 将以上三种样品混合，37℃下共同保温15分钟。
5. 将样品混合物加入到3 ml LB培养基中，37℃震荡培养3-4小时。 6. 将试管放于65-70℃水浴20分钟，3000转/分，离心15分钟。
7. 将上清转入新的离心管中，已发生剪切的phage particles在上清中（上清可
在4℃下储存1-2月）。
8. 将100ul phage 上清+200ul SOLR cells（OD600=1.0）混合，37℃保温15分钟。 9. 取步骤8中溶液5-10 ul涂于LB-amp agar plates（amp=50ug/ml），过夜培养。 10. 第二天细菌长出，随机挑取单克隆接种到LB-amp培养基中培养过夜。 11. 过夜培养细菌分为三部分：（1）提取质粒做双酶切，鉴定外源基因的大小；
（2）送样品进行DNA测序（3）加入30-40%的甘油进行保种，分装成小份储存于-80℃备用。 附录：
1、SM buffer (1L):
(5.8 g NaCl+2.0 g magnesium sulfate+50 ml 1M Tris (pH=7,5)+0.1 g gelatin) 2、AP-buffer:
(100 mM Tris HCI (pH 9.5) ; 100 mM NaCl ; 5 mM MgCl2) 3、10xTBS（1L）：
（0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)；1.5 M NaCl） 4、LB Broth（1L）：
（10 g NaCl+10 g of tryptone+5 g of yeast extract）
ELISPOT
19
1. PBS溶解抗原为30 μg/ml，加100 μl/孔于PVDF膜铺底的96孔灭菌板过夜； 2. 第二天吸去包被液后，加5％FCS的PRMI 1640培养基100 μl封闭1小时，37 oC；
3. 准备脾细胞悬液（用氯化铵去除红细胞，制备成单个脾淋巴细胞悬液）； 4. 从1 × 106/孔开始，按1:3的稀释度开始逐孔稀释做不同浓度梯度，并做3个复孔，37 oC静臵培养5小时；
5. PBS洗3～5次，生物素化的抗鼠IgG二抗孵育30 min； 6. PBS洗3～5次，链亲和素标记的碱性磷酸酶孵育30 min；
7. PBS洗3～5次，用底物BCIP/NBT显色，显微镜下观察显色反应，显色后及时终止反应；
8. 计数每孔中的斑点数目，计算每106个脾细胞中抗体分泌细胞数量。
藻酸盐包裹实验
1. 将藻酸钠溶于无菌生理盐水，终浓度为1.5%；
2. 收集培养的肿瘤细胞，用无血清的培养基洗涤1次，将细胞沉淀重悬于1.5%藻酸钠溶液中；
3. 将上述肿瘤细胞悬浮液用1 ml加样枪缓慢滴入磁力搅拌的250 mM CaCl2溶液中，形成乳白色的藻酸盐小珠。继续静臵于250 mM CaCl2中30 min即可使用。以上操作步骤均在无菌条件下进行；
4. 将第4次免疫后7天的小鼠用苯巴比妥钠0.1ml (按100 mg/kg计) 腹腔注射麻醉，小鼠麻醉后臵于解剖台上，切开背部皮肤，皮下植入4粒藻酸盐包裹颗粒，缝合皮肤，外敷手术胶膜；
5. 天以后，小鼠经尾静脉注入100 μl (按100 mg/kg计) FITC标记的葡聚糖(FITC-Dextran)；
6. 20 min后处死动物，取出藻酸盐颗粒，常温下加入1 ml的生理盐水，剪碎研磨颗粒，再加入1 ml的生理盐水,混匀标本，放臵1小时，1500 rpm离心5 min。取上清液用荧光酶标仪测定；
7. 用不同浓度的FITC-Dextran制备标准曲线。
重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作
（细菌内同源重组AdEasy System）
20