2、注意：
单细胞浓度应约106/ml，以免影响检测的CV值和检测结果；
制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量（如细胞是否聚集或过多
碎片），以保证得到足够的细胞含量； 醛类固定会影响PI与核酸的结合。
四、免疫荧光标记法
1、细胞膜上的免疫荧光检测法 间接标记法
1) 制备单细胞悬液；
2) 细胞计数，取出1×106个细胞于试管中；
3) 用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 >90～95%；
4) 在试管中加入一抗，（剂量按照说明书的要求），孵育30～60分钟； 5) PBS洗涤1～2次，1500rpm，离心3分钟，弃上清； 6) 加入二抗，孵育20～30分钟；
7) PBS洗一次，1500rpm，离心3分钟，弃上清;
8) 加300μl PBS，上机检测(若不能及时上机检测，可加1ml 1%多聚甲醛固
定，可放臵1周)。 直接标记法
①～③同间接标记法
④在试管中加入荧光标记的抗体，混匀，孵育30分钟； ⑤用PBS洗2次，1500rpm，离心3分钟，弃上清; ⑥加300μl PBS(PH=7.4)，上机检测。 2、 细胞膜内的免疫荧光标记法 间接免疫荧光标记法
1) 取已制备好的单细胞悬液，用1～3%的多聚甲醛固定30分钟（也可4℃
保存过夜）；
2) 用PBS洗两次，弃上清；
3) 细胞膜打孔，加入0.1%皂素 200μl，室温10分钟； 4) 用PBS洗涤两次；
5) 加入第一抗体，室温30～60分钟，或4℃过夜，同时须设阴性对照或同
型对照管； 6) 用PBS洗涤两次；
7) 加入二抗（荧光标记的抗体）室温20分钟，避光； 8) 用PBS洗涤1～2次，弃上清；
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9) 重悬细胞于500μlPBS中，上机检测。 直接荧光标记法
①～⑤同间接荧光标记法；
加入荧光素标记好的抗体，避光30分钟（同时做同型对照管）； 用PBS洗涤１～２次，弃上清； 加300μl PBS上机检测。
细胞膜上及细胞内双标记法（直标法）
1) 取出已制备好的未固定的单细胞悬液1×10 6个细胞于试管中； 2) 用PBS洗涤两次；
3) 加入用荧光素标记的抗体来标记细胞膜上的抗原，同时加上阴性对照管，
室温孵育20分钟；
4) 在试管中加入1％～3％多聚甲醛1ml，固定30分钟； 5) PBS洗涤两次1500rpm 3分钟，弃上清; 6) 打孔，加入0.1％皂素200μl室温10分钟; 7) 用PBS洗涤两次，弃上清;
8) 加入用荧光素标记的抗体，标记膜内的抗原（标记膜内的抗体的荧光素
的颜色与膜上标记的荧光素的颜色务必不相同）室温20分钟孵育; 9) 用PBS洗一遍弃上清；
10) 用300μlPBS重悬细胞，上机检测 五、流式细胞术中的几点注意事项： 1、对照组的设臵：
在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是绝对值。如需知道绝对值
时必须设臵对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。
（1）、阴性对照的设臵
? 在实验过程中，如做间接标记法，可设臵与一抗无关的实验，即在
实验中不加一抗而只加上带有荧光标记的第二抗体作为阴性对照管，作为阴性对照。
? 在实验过程中，假设做直接标记法，可设臵理论上的阴性细胞作为
阴性对照管，实验过程及步骤与实验组务必相同。（做间接标记法时，同样也可同时设臵“阴性细胞”的阴性对照管作为阴性对照。 ? 在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加
上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。
（2）、阳性对照的设臵：
在实验过程中如涉及到表达缺失或减少的实验，应设臵阳性对照组，其
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设臵方法与阴性对照设臵相同。
2、几点建议：
1) 在实验过程中，在保证实验的科学性和准确性的基础上，应尽量减少实验工
序和过程。由于间接标记法的工序多，实验过程长，如再加之操作的不熟练，细胞更容易丢失和受损，而造成实验结果的误差。因此，在条件允许的范围内，建议尽量做直接标记法而不去做间接标记法，以保证实验的真实性和准确性。
2) 建议送检细胞一定要足够量，一般要求1×106个细胞。不要过少。因为，如
细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数，结果也不可信。细胞量也不宜过多，因细胞量太多加入的抗体或染料相对不足，结果也由此受影响。
3) 同一种细胞需同时做双标记时，须做双标记的同型对照，且两种抗体所标记
的荧光颜色务必不同。
Western Blot(免疫印迹法)
主要包括以下4个基本步骤：
? 样品制备 ? 电泳分离 ? 蛋白的膜转移
? 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂
? 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) ? Modified RIPA buffer
Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM ? 1X SDS 样品缓冲液
62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于 25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 ? 转移缓冲液
25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3) ? 10X Tris缓冲盐 (TBS)
准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为 7.6 ? 脱脂奶粉或BSA ? 甲醇
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? TBS/T缓冲液
1X TBS, 0.1% Tween-20 ? 封闭缓冲液（TBS/T）
1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA ? 一抗的稀释
1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% BSA (多抗)或 5%脱脂奶粉(单抗) Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗
体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
? 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
1．培养细胞或药物处理。
2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或 75 cm2 plate, 500-1000
μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声 10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。
7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至 SDS-PAGE 胶 (10 cm x 10 cm)电泳。
如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150 cm2 flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设臵内或外参照，通常用beta-actin。
注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜
杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋
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白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤。
1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。
注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。 2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用
PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。
3. 装配转移三明治：海绵?3层滤纸?胶?膜?3层滤纸?海绵，每层放好后，
用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。
4. 将转移槽臵于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，
插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。 5. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜
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免疫杂交与显色
1． 用25 ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。 2． 臵膜于25 ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。 3． 15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
4． 加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。 5． 15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
6． 加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二
抗，室温孵育1h，缓慢摇动。 7． 15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。 8． 15 ml TBS洗1次。
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