PrimerSelect的使用方法 PrimerSelect能够帮助你设计PCR，测序和交杂实验所使用的引物和探针。输入你的DNA，RNA或反向翻译的蛋白质模板序列后，PrimerSelect就可以在pentamer窗口计算序列的融解温度，自由能和末端自由能。您可以通过控制包括引物浓度、盐分和.G计算温度等参数来限定计算结果。
在模板处理后，PrimerSelect按照用户定义的参数确定引物的位置，并给引物评分，然后筛选出模板序列上的最佳引物序列。引物“workbenches”允许你修改你的引物，检查参数编辑对翻译读框，二级结构，错误的引物位置和限制性酶切位点的影响。如果你选择并优化了你的引物，PrimerSelect可以让你建立有关模板，引物，扩增的文件。和全部Lasergene的应用程序一样，PrimerSelect也提供整合的BLAST查找功能。
创建PrimerSelect文件 我们将以克隆载体pBR322为模板DNA序列。在这一节中，我们选择引物，用来扩增位于2013-2169位的H-strand Y effector。首先我们从打开模板序列开始。
? 从文件菜单选择New创建
一个PrimerSelect文件。 ? 从文件菜单，选择输入序
列（Enter Sequence）。打开下面的对话框。 ? 从“Demo Sequences”选中pbr322.seq（视窗口）的文件，或者PBR322（苹
果计算机），单击Add添加序列到右面的窗口。然后点击Done打开序列。
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定义引物特点和位置
下面我们开始确定引物的类型。
? 从条件菜单（CONDITIONS MENU），选择Primer Characteristics打开左面
的对话框。这对话框可以用来设定各种参数诸如：引物长度、最大的3’
pentamer稳定性和可接受的重叠。注意默认的引物长度为17-24 bp，并且1或2 bp的二聚体和发卡样重叠示可以接受的。
? 不改变默认设定和单击Cancel退
出。
? 从条件菜单，选择Primer
Locations打开右边对话框。这个对话框允许我们根据给的序列的长度来限制引物的位置。
? 从下拉菜单的Restrict
Locations中选择Upper and Lower
Primer Ranges。当在全序列中设计编码区的PCR引物时，这是最好的选择。
? 在Upper Primer Locations右面的
方框中输入1700和1950。在Lower Primer Locations右面的方框中输入2250和2500。
? 单击同意，会出现左面的窗口。成
对的绿色和红色的三角形分别标记所设定的正向和反向引物的范
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围。
寻找引物对
现在我们已经指定什么种类的引物对是可接受的，剩下的工作就是让PrimerSelect为我们寻找理想的引物对。 ? 从LOCATE MENU选择PCR Primer Pairs。打开一个二分窗口，
上面窗口中显示计算机寻找到的28对理想引物对，引物对按照评分值依次排列。因为调色板工具中的Alternate Pairs被默认激活 （在窗口左面工具中），所以底部窗口显示的
是上面窗口选定的引物对的替代引物对一览表。
? 通过拖动在窗口的右侧上的小环拉开建议窗口，可以查看PrimerSelect对
选定引物的建议。
注意现在的“Best choice.”是PrimerSelect根据在最初的条件中设定的参数计算得到的。看下面的窗口，PrimerSelect列出了“Best choice”引物对的25替代选择。这些替代的引物对扩增的区域和上面选定的引物一样，所不同的是他们的序列有些不一样。
? 选择调色板工具中的Alternate Products（左侧工具底部），下面窗口显示
引物的位置和可能错配的位置，以及相应的产物长度。左面的那个单一的粗黑棒提示用我们“Best choice”引物进行反应，会有大量产物被扩增出来。如果没有多个5’或者3’引物箭头也提示这一对引物没有错配点。 ? 单击上面窗口里引物对，观察下
面窗口里的产品棒变得越来越细表示预期的扩增物也越来越少。
注意有8个引物对有错误的配对点，用粉红色或淡绿色箭头指示出来。第
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13对和第22对正向引物有错配点（右边显示），就会用第二条产品棒的表示错误的产品大小。
查看引物的其他信息
PrimerSelect能预测引物形成self-dimers, pair-dimers and hairpins的可能性。
? 单击选定“Best choice”引物。 ? 从报告菜单（REPORT MENU），选Amplification Summary，打开左面的窗口。
显示用所选个引物做PCR扩增反应的报告。 ? 选择Composition Summary，打开
左面的窗口，描述扩增区和引物对的碱基组成。
? 从报告菜单，选择Self Dimers，
Pair Dimers和／或Hairpins打开新窗口显示每种二级结构的预测结果。Self-Dimer形成窗口如右。
按照引物特点分类
PrimerSelect在自动将引物按照从好到坏的顺序分类以前，已经计算了引物的各个特点。Located Primers & Probes窗口是我们能够根据引物的不同特点，如引物位置、长度、溶解点或自由能等，来对引物进行分类。这里让我们用溶解
点来分类引物。
? 从报告菜单，选择Located Primers & Probes打开左面的窗口。窗口显示
符合我们标准的引物的一览表。在没有特别指定的情况下，引物按照位置排列。
? 从LOCATE MENU选择Sort Primers打开下边对话框。
? 保留对正向和反向引物的选定，去除对By Position的选定。选定By Tm
Nearest方框，输入65。
? 单击同意，现在两个窗口里的引物按照
融解温度离65oC最近的程度依次排列。
改变引物长度
PrimerSelect’s工作台允许你在引物中引入限制性酶切位点，突变，改变使用的密码子，核查引物二级结构，查找错配点。在这
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一节中，我们将用正向引物工作台来扩展我们的引物长度。 ? 双击选定正向“Best choice”引物。
? 从编辑菜单，选择Work on Upper Primer打开下面的窗口。
? 确认Dimer，Hairpin和Priming Sites调色板工具（窗口左侧从顶端起的
4-6）已经激活。
让我们仔细查看一下工作台。在窗口下边的第3排可以看见引物序列。序列两端的三角形“handles”允许你缩短或者延长序列。在窗口的左上角的标题告诉我们引物的长度是23核苷酸，溶解温度为65.5度；而底部窗口的绿色棒显示引物在序列上的大概位置。下面的信息告诉我们没有大于2 bp的二聚体形成，并且引物只能形成一个并不理想的发卡样结构。拖动窗口左边的滚动条之间的黑框调整上下窗口的比例。
? 拖动引物左上黑三角形直到长度延伸到33核苷酸。
现在引物的长度已经显示在窗口的标题中。引物的溶解温度也增加到78.6度，将难以进行PCR。看下面的窗口有二聚体和发卡形成，并标记（坏！）。由于长引物容易形成稳定的二聚体和发卡样结构，所以我们设计的引物经常较短。 ? 再一次拖三角直到引物最初的23核苷酸。窗口又和我们开始打开它的时候
一样了。
引物中引入突变
PrimerSelect工作台可以很容易的在引物中引入突变。我们“Best choice”的正向引物序列只编码一个苯丙氨酸。在这一节中，我们把读框1的苯丙氨酸通过改变读框中的密码子转换成苏氨酸。转换完成后我们将可以观察到我们变化的效果。
? 点击引物下面，读框1中绿色的苯丙氨酸，会
出现一个小盒子（如右）。盒子中显示全部4种可能的苯丙氨酸密码子和词“Other.”标记的GCC是这个苯丙氨酸残基的密码子。
? 选择Other会自动跳出一个子菜单，其中显示
所有的氨基酸及其代号，在“T-Threonine.”上点击一下，模板序列上的碱基组成没有改变，但是引物序列和其编码的氨基酸（Thr-Ala）发生了改变。
Thr显示为红色，表明它是从最初的引物序列上突变得到的。查看屏幕底部的左角，可以看到引物形成了一个稳定的二聚体。我们可以通过给我们的Thr残基做沉寂突变来删除这个不受欢迎的二聚体。我们试着把苏氨酸的密码子改变为ACC。这个密码子与苯丙氨酸密码子（GCC）只有一个核苷酸不同。
? 单击红的Thr残基，从菜单中选ACC代替现在的ACT。 下面的窗口显示从G到A的单一的核苷酸变化去除了二聚体。另外，正向引物的融解点已经从65.5减少了到53.7。也许正向引物新的溶解温度可以与反向引物匹配，但是我们可以找到与之更相匹配的反向引物。 ? 在工作台的右上的白色文框输入突变引物的名字。
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