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硕士学位论文
烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
Functional analysis for the ORF3 of Tobacco bushy top virus
硕士研究生：左瑞娟
指 导 教 师：李 凡 教授 陈海如 教授 申请学位类别：农学硕士 专 业： 植物病理 培 养 学 院 ： 植物保护学院
二O一O年六月
Functional ananlysis for the ORF3 of Tobacco bushy top virus
A Thesis Submitted to Yunnan Agricultural University
In Special Fulfillment of the Requirement for the Master
Degree of Plant Pathology
Candidate: Zuo Ruijuan Supervisor: prof. Li Fan prof.Chen Hairu
College of Plant Protection Yunnan Agricultural University Kunming 650201, P.R. CHINA
June, 2010
烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得云南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名： 时间： 年 月 日
关于学位论文使用授权的声明
本人完全了解云南农业大学有关保存、使用学位论文的管理办法及规定，即：云南农业大学有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意云南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)
研究生签名： 时间：2010 年 6 月 7 日
导师签名： 时间： 年 月 日
烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
目 录
摘 要........................................................................................................................ 6 ABSTRACT ................................................................................................................... 7 1 引言............................................................................................................................ 9 1.1 烟草丛顶病研究进展 ......................................................................................... 9 1.1.1 烟草丛顶病发生及分布 ..................................................................................... 9 1.1.2 烟草丛顶病症状及传播途径 ............................................................................. 9 1.1.3 烟草丛顶病在中国的危害 ................................................................................. 9 1.1.4 烟草丛顶病病原物归属及其特征 ................................................................... 10 1.1.5 烟草丛顶病的综合防治 ................................................................................... 10 1.2 烟草丛顶病毒研究进展 ................................................................................... 10 1.2.1 烟草丛顶病毒国内外研究进展 ....................................................................... 10 1.2.2 烟草丛顶病毒基因组结构 ............................................................................... 11 1.3 基因功能研究方法 ........................................................................................... 11 1.3.1 基因反义技术 ................................................................................................... 12 1.3.1.1 反义寡核苷酸技术 ........................................................................................ 12 1.3.1.2 反义RNA技术 ............................................................................................. 13 1.3.1.3 核酶技术 ........................................................................................................ 13 1.3.2 RNAi（RNA interference）技术 ...................................................................... 14 1.3.3 基因敲除、嵌入技术 ....................................................................................... 14 1.4 幽影病毒基因功能研究 ...................................................................................... 15 1.4.1 幽影病毒属成员 ............................................................................................... 15 1.4.2 幽影病毒属成员基因组结构 ........................................................................... 15 1.4.3 幽影病毒的ORF1和ORF2功能研究 ........................................................... 16 1.4.4 幽影病毒的ORF3基因功能研究 ................................................................... 17 1.4.5 幽影病毒的ORF4基因功能研究 ................................................................... 18 1.5 烟草丛顶病毒ORF3基因功能研究 ............................................................... 18 1.5.1 烟草丛顶病毒ORF3基因功能研究的方法 ................................................... 19
1.5.1.1 病毒载体PVX基因置换........................................................................ 19 1.5.1.2 农杆菌介导重组病毒载体pGR107-ORF3、pGR107-GFP-ORF3 ...... 20 1.5.1.3 免疫胶体金标记...................................................................................... 22 1.5.2 烟草丛顶病毒ORF3基因功能研究的意义 ............................................. 23 2 材料与方法.............................................................................................................. 24 2.1 材料 ................................................................................................................... 24
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烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
2.1.1 病毒来源 ........................................................................................................ 24 2.1.2 抗血清 ............................................................................................................ 24 2.1.3 植物材料 ........................................................................................................ 24 2.1.4 菌种及载体 .................................................................................................... 24 2.1 方法 ................................................................................................................... 25 2.2.1 烟草丛顶病毒ORF3基因的克隆及测序 ....................................................... 26
2.2.1.1 烟草丛顶病毒ORF3引物设计和合成 .................................................. 26 2.2.1.2 烟草丛顶病病叶总RNA的提取（MRCgene公司的Tri Reagent） ........ 26 2.2.1.3 RT(cDNA合成)（20μL反应体系）（Promega 公司的M-MLV Reverse Transcriptase） ........................................................................................................... 27 2.2.1.4 PCR（25μL反应体系）（TaKaRa公司rTaq DNA聚合酶） .................... 27 2.2.1.5 PCR产物割胶回收（Axygen公司割胶回收试剂盒） .............................. 27 2.2.1.6 克隆载体pMD18-T与扩增片段ORF3连接（TaKaRa公司的T4连接酶） ..................................................................................................................................... 28 2.2.1.7 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备（萨姆布鲁克等，2002） ................ 28 2.2.1.8 转化及蓝白斑筛选（萨姆布鲁克等，2002） ............................................ 28 2.2.1.9 重组质粒pMD18-ORF3提取（TIANGEN高纯度质粒小提试剂盒） ... 28 2.2.1.10 重组质粒pMD18-ORF3的PCR鉴定 ...................................................... 29 2.2.1.11 重组质粒序列测定 ...................................................................................... 29 2.2.1.12 TBTV ORF3序列分析 ................................................................................ 29 2.2.2 pGR107-ORF3载体构建 .................................................................................. 29 2.2.2.1 克隆载体pMD18-T-ORF3及双元载体pGR107 Sal I/Spe I酶切（反应体系20μL）（TaKaRa公司的Sal I/Spe I） ................................................................. 29
2.2.2.2 分别割胶回收目的片段ORF3及缺失cp基因的pGR107载体（Axygen公司割胶回收试剂盒）....................................................................................... 30 2.2.2.3 缺失cp基因的pGR107载体与目的片段ORF3连接 ........................ 30 2.2.2.4 农杆菌GV3101感受态细胞制备(卢圣栋，1999) ............................... 30 2.2.2.5 冻融法转化农杆菌(卢圣栋，1999) ....................................................... 30 2.2.2.6 pGR107-ORF3质粒提取 ......................................................................... 30 2.2.2.7 PCR检测pGR107-ORF3质粒目的片段 ............................................... 30 2.2.2.8 含重组质粒pGR107-ORF3农杆菌GV3101注射接种本氏烟 ........... 31 2.2.2.9 PCR检测接种GV3101(pGR107-ORF3)植株系统叶片（R Li et al，2008）............................................................................................................................... 31 2.2.2.10 RT-PCR检测分别接种GV3101(pGR107-ORF3)及GV3101(pGR107)
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