烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
(nuclear shuttle protein)或者ORF3蛋白与寄主植物的细胞因子共同参与了核的穿梭（Ryabov E V et al，1998）。
1.4.5 幽影病毒的ORF4基因功能研究
幽影病毒的ORF4编码产物在PEMV-2、CMoMV、GRV和TBTV间有43.4%-62.8%的相似性（Ryabov E V et al，1999；Nurkiyanova K M et al，2001；Ryabov E V et al，1999）。Taliansky等发现GRV的ORF4 基因产物的氨基酸序列同黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）病毒的3a-MP（该蛋白31kDa，同CP一起执行CMV的细胞间运动）具有序列相似性（Taliansky M E et al，2003），故推测GRV的ORF4产物为GRV的 MP。Ryabov等发现融合了绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的GRV的ORF4蛋白主要集中在侵染细胞与其附近细胞相连的胞间连丝内，同时还发现GRV的ORF4蛋白还能够代替PVX的MP行使病毒的细胞间运动（Ryabov E V et al，1998）。Ryabov等用GRV的ORF4 代替CMV的3a-MP和CP，发现重组病毒可以在侵染寄主的细胞间传播，而融合了GFP的ORF4产物集中在侵染细胞间的胞间连丝内 （Ryabov E V et al，1999)。Nurkiyanova等以GRV的ORF4分别代替TMV、PVX的MP编码区并插入GFP基因作报告基因构建了侵染性克隆表达载体，将重组病毒转入本氏烟原生质体内，发现GRV ORF4产物能够在原生质体表面形成管状结构，这一特性也是某些植物病毒MP所具有的性质；他们在大肠杆菌中表达了GRV ORF4编码的蛋白，进行RNA结合能力的测试，发现GRV ORF4编码的蛋白能够同GRV RNA相互作用形成复合体，同其它病毒MP与病毒RNA形成的复合体相比，结构较松散、复合体中蛋白比例较低（Nurkiyanova K M et al，2001）。由此证明了幽影病毒的ORF4 编码的蛋白可能是该类病毒执行病毒细胞间运动的功能蛋白。
1.5 烟草丛顶病毒ORF3基因功能研究
由于幽影病毒属成员基因组无编码外壳蛋白的基因这一特殊性，对基因功能研究带来了新的挑战。对幽影病毒其它成员的研究表明，幽影病毒的ORF3编码蛋白具有帮助病毒进行长距离运输(1ong—distance movement)以及延长病毒RNA稳定性的功能（Ryabov E V，1999；Ryabov E V，2001），同时ORF3蛋白还是一个细胞核的穿梭蛋白(nuclear shuttle protein)，可能在病毒RNA的复制中起一定的作用（Ryabov E V，1998）。因此，幽影病毒虽然不编码外壳蛋白，但其ORF3蛋白除了不具备结构蛋白的功能外，可能具有其它病毒CP所具有的某些相似功能（李凡等，2005）。根据幽影属中研究最为全面的花生丛簇病毒ORF3研究的启示，本论文采用了多种基因功能研究的方法相结合来研究烟草丛顶病毒ORF3基因功能。
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1.5.1 烟草丛顶病毒ORF3基因功能研究的方法 1.5.1.1 病毒载体PVX基因置换
利用病毒载体在植物体内表达某一外源基因，通过植株表型的变化来了解基因的功能。目前已构建多种病毒载体，常用的病毒载体有烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)、番茄金色花叶病毒(Tomato golden mosaic virus，TGMV)、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)、大麦条状花叶病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)、甘蓝曲叶病毒(Cabbage leafcurl viurs，CbLCV)、番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）和雀麦花叶病毒（Brome mosaic virus，BMV）等(Burch-Smith T M et al，2004；王宏芝等2005)。
其中PVX是马铃薯X病毒属(Potexvirus)的模式成员，其病毒粒子为易弯曲的杆状颗粒，大小约为13nm × 515nm。其寄主范围广，系统侵染的主要是茄科植物，受侵染寄主的叶片呈花叶症状。PVX基因组是单组分+ssRNA，长度约为6.4kb，包括5个ORF(Doronin S V et al，1996； Huisman M J et al，1988)。ORF1编码165kDa RNA聚合酶，是RNA合成所必需的唯一一个来源于病毒的蛋白质；ORF2-ORF4三个基因互相重叠，称为三基因区段(Triple gene block，TGB)，分别编码25kDa、12kDa、8kDa蛋白，这些蛋白与病毒在细胞间的移动有关， 称为移动蛋白(movement protein，MP)；其中25kDa蛋白已经被证明是一种转录后基因沉默的抑制因子，打破寄主植物的防御反应使病毒成功侵染(Carrington J C et al，2001)。ORF5编码PVX 的25kDa外壳蛋白(coat protein，CP)亚基，除了包装核酸外，还是病毒细胞间移动所必须的，并且在复制调节上也起重要作用(Chapman S et al，1992)。
图1 -3 PVX基因组结构(以CP株系为例)（引自曲静等，2003） Fig1-3 Genomic organization of PVXcp（from Qu Jing et al，2003）
PVX作为表达载体具有转化途径简单、可迅速得到高拷贝的外源基因等优
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点。因此近年来无论在基础研究还是应用研究上都得到了广泛的重视。载体的构建主要采用基因插入（Chapman S et al，1992）和融合蛋白（O‘Brien G J et al，2000）的策略。采用基因插入策略时，在病毒CP强启动子之后插入外源基因，依赖于CP强启动子来指导外源基因的表达。采用融合蛋白策略时，在CP基因前插入外源基因和通读序列，利用CP能够与外源蛋白形成融合蛋白的特点，使得病毒在组装的时候，巧妙的将目的蛋白呈现在病毒粒子的表面（曲静等，2003）。
PVX作为载体的应用已经有很多成功的例子，它介导的外源基因表达可以被转基因植物中的共抑制现象所抑制，用PVX做载体进行这方面的实验有助于了解转基因沉默的机制和RNA介导的病毒抗性。例如，将gfp基因插入重复的PVX CP启动子之间，转化转gfp基因的植株，使之发生基因沉默（Thomas C L et al，2001）。PVX载体还可应用于病原物与植物的互作研究。例如，用PVX做载体将真菌的无毒基因Avr9和卵菌的无毒基因infi导入烟草中， 引起烟草对PVX 的HR反应，证明真菌或卵菌的激发子由一个不相关的病原来表达时，也能激发植物的防卫反应，从而说明基因对基因互作能转移到不同的病理体系(Kamoun S et al，1999)。
本文选用由英国John Innes Center的Baulcombe教授实验室开发的当前国内外普遍应用的PVX载体系统中的pGR107载体，其载体上CP基因前有一个强CP启动子，保证了cp基因在植物体内的表达。通过将TBTV的ORF3置换pGR107载体的cp基因，分别构建pGR107-ORF3和pGR107-GFP-ORF3重组病毒载体，根据重组病毒载体pGR107-ORF3和pGR107-GFP-ORF3及野生型pGR107病毒载体侵染植物后的表型及病毒核酸和蛋白检测结果，来研究ORF3基因的功能。
1.5.1.2 农杆菌介导重组病毒载体pGR107-ORF3、pGR107-GFP-ORF3
农杆菌(Agrobacterium)是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性土壤杆菌，分为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(A．rhizogenes)，能侵染植物的受伤部位，导致冠瘿瘤(Crown gal1)和毛状根的发生(李淑萍，2005)。1974年，Zeanen等从根癌农杆菌中分离出一巨型质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid)，简称Ti质粒，在发根农杆菌中则存在Ri质粒(Root-inducing plasmid) ( Zambryski P C，1992)。随后在Ti(或Ri)质粒上发现有可整合到植物基因组中的农杆菌质粒DNA片段，命名为转移DNA(Transfer DNA)，简称T-DNA。T-DNA内部有致瘤和冠瘿碱(Opines)形成等有关基因（Chilton M D et al，1977）。
Ti质粒上除含有可转移DNA (T-DNA)区，还含有毒性区(Vir区)，结合转移区(Con区)和复制起始区(Ori区)4部分，其中与冠瘿瘤生成有关的是vir区和T-DNA。T-DNA 区在农杆菌侵染植物时可以插入植物基因组中，使其携带的基因在植物中表达，T-DNA两端是25 bp的重复序列，是转移识别的唯一信号，分为左边界和右边界，两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基
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因。vir区用于编码T-DNA加工，转移及整合的功能蛋白，该毒性区含有多个位点，如 VirA，VirB，VirC，VirD，VirE，VirF，VirG，VirH等，每个位点包括1到11个开放阅读框。当植物受到伤害时，分泌含有酚类化合物的汁液，这些酚类化合物促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面，随后VirA 的蛋白感受植物受伤细胞产生的信号(酚类化合物，糖类等)，自身发生磷酸化，磷酸化的VirA蛋白将磷酸基转移到VirG蛋白保守的天冬氨酸残基上，使VirG蛋白活化，从而激活其它vir基因的转录；其中，VirD基因产物对T-DNA进行剪切，产生T-DNA单链，T-DNA 单链与VirD2及VirE2结合成T链复合物，T链复合物被转移到农杆菌外，通过植物细胞壁上由VirB蛋白组成的通道进入植物细胞内，VirD2和VirE2上的核定位信号被转运蛋白识别，经过主动运输过程通过核孔进入细胞核内，在VirD2的帮助下，T-DNA 以单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上，完成T-DNA 由农杆菌向植物的转移及整合过程（徐春晖等，2002）。研究表明T-DNA 优先整合到转录活跃区，而且在T-DNA的同源区与DNA的高度重复区，T-DNA的整合频率也比较高（Zambryski P C，1992）。
1993年瑞士科学家Rossi等以烟草幼苗为转化受体创建了农杆菌真空渗透瞬间表达体系。他们将带有重组质粒的农杆菌经诱导后，通过抽真空渗透入植物幼苗中，2-3d后即可检测到重组蛋白的瞬间表达（Raineri D M et al，1993）。Kapila等在菜豆叶片中也建立了高效的农杆菌真空渗透瞬间表达体系。同时对农杆菌渗透后的叶片组织横切面的电镜观察发现，真空渗透只使得农杆菌进入到细胞间隙内并与内层细胞紧密接触，而有利于T-DNA的转移，但它并没有破坏植物细胞壁。农杆菌T-DNA的转移还有赖于Vir区基因表达的特异性蛋白的作用（Kapila J et al，1997；Bohon G et al，1986）。在此基础上，Yang等利用针管注射法代替真空渗透，将农杆菌渗入烟草活体植株叶片上，成功进行农杆菌介导的基因瞬间表达检测(Yang Y N et al，2000)。后来，Spolaore等利用针管注射法在成熟水果中作外源蛋白的瞬间表达分析，在所实验的各种水果(苹果、梨、桃、橘子、草莓和番茄)中都成功地表达出了GUS蛋白（Spolaore S et al，2001）。现将真空渗透和针管注射两种农杆菌渗入法所进行的基因瞬间表达技术体系统称为农杆菌渗入（Agroinfihration）系统。目前已在很多植物上成功地建立Agroinfiltration系统，如烟草、拟南芥、菜豆、番茄、胡椒、长春花、柠檬、莴苣和酸樱桃等，并且已广泛应用于外源基因功能与细胞定位分析、启动子分析、基因沉默、生产重组蛋白等多个领域（于翠梅等，2007）。
在Ti质粒转化到植物体内存在两种整合方法（刘巧泉等，1998）：共整合载体(co-integrative vector)法是使用无毒的Ti质粒作供体载体，因此又称为 one-载体法。在供体载体中己经缺失的T-DNA 区段，由一段pBR322DNA所取代，供
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体质粒的主要功能是提供Vir区的用于T-DNA转移的一些功能。外源基因必须先克隆在 pBR322 质粒或其衍生质粒上，作为中间载体，然后通过二者相同的pBR322序列发生同源重组形成质粒共合体；双元载体(binary vector)法的基本特点是由两个彼此相容的Ti质粒构成，一个是辅助质粒，包含 T-DNA 转移必需的Vir区片段，另一个是穿梭小质粒，其含有T-DNA区段。穿梭载体由于分子量小，它能够在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌中复制，并能够从大肠杆菌转移到根癌农杆菌中，易于进行一般的遗传操作，容易将任何待研究的外源DNA插入到其T-DNA区段。双元载体系统的优点在于它不需要构建质粒共合体，系统的两个质粒不需要有同源区，为质粒的构建提供了方便。
农杆菌介导的病毒侵染(Agrobactertum-mediated virus infection，Agroinfection)方法，是指农杆菌Ti／Ri质粒载体将病毒或类病毒的核酸导入植物并形成侵染的过程(Dasgupta I et al，1991；Grimsley N H et al，1987)，它是由Grimsley建立的，其原理是农杆菌Ti／Ri质粒上的T-DNA区能将插在其中的病毒或类病毒基因组转移整合到植物细胞中并表达出来。然后通过下面的两种方法之一导致转化植物的系统感染：(1)含有一个以上完整的病毒基因组串联插入T-DNA中后，重复的病毒基因组发生同源重组产生环状和完整的病毒DNA或通过T-DNA 的复制产生完整的病毒粒子，从而在受体植株中发展成为系统侵染；(2)通过整合过程，即携带完整病毒基因的T-DNA整合到植物细胞中，转化的细胞增殖并分化形成转基因植株，其每个细胞的DNA都携带有病毒的基因，随着植物基因组的复制转录，病毒基因脱离植物基因组而产生具有活性的病毒粒子，从而完成病毒侵染植物的过程(施骏等l993)。
本文选用农杆菌GV3101（含辅助质粒pJIC Sa-rep），其中pJIC Sa-rep的作用是保证PVX及其衍生的病毒载体在农杆菌中顺利复制（王宏芝，2007）。利用pJIC Sa-rep——Ti质粒转化到植物体内的双元载体法将病毒载体pGR107在辅助质粒pJIC Sa-rep的帮助下，完成农杆菌介导病毒载体pGR107在烟草植株中的侵染。
1.5.1.3 免疫胶体金标记
1971年，Faulk和Taylor首次将胶体金用于电子显微镜作为免疫染色标记（Faulk W P et al，1971），随后免疫胶体金标记广泛应用于细胞生物学、微生物学、病毒学等领域的研究。1983年，Lin等人将胶体金技术成功地应用到植物病毒检测，他们将免疫胶体金标记在超薄切片上定位植物病毒（Lin N S et al，1983）。目前已有多种植物病毒运用了该技术进行了检测、研究。1987年，Lin等人又用免疫胶体金标记了马铃薯黄矮病毒（Potato yellow dwarf virus，PYDV）结构蛋白，发现染病细胞核核质中积累了大量的结构蛋白（Lin N S et al，1987）。除了结构蛋白被标记外，还有大量植物病毒的移动蛋白等被标记。
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