烟草丛顶病毒ORF3的功能分析
The distribution of the ORF3 and ORF4 encoded proteins were attemptted to analyze by immunogold labeling with the antiserums of TBTV ORF3, ORF4 protein in the cells of tobacco bushy top diseased plants. Most of the gold particles could be detected in nucleuses, plastosome, chloroplast, cytoplasm of ordinary cells. However, only ORF4 protein located in plasmodesma and only ORF3 protein located in sieve tube cells. These further illuminated that ORF3 protein was involveed in the virus long distance transportation, and ORF4 might be relate to virus cell-to-cell movement.
Key words: TBTV; ORF3; Functional analysis; pGR107 virus vector; GFP;Western bolt; Fluorescence electron microscope; immunogold labeling technique
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1 引言
烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus，TBTV）是一种单分体线型+ssRNA（positive sense single-stranded RNA）病毒，是引起烟草丛顶病（Tobacco bushy top disease）的病原物之一（Murant A F et al，1995；Van Regenmortel M H V et al，2000；Mo X H et al，2002）。2005年ICTV（International Committee on Taxonomy of Viruses）第八次病毒分类报告已将TBTV归为幽影病毒属（Umbravirus）成员（Taliansky M E et al，2005）。
1.1 烟草丛顶病研究进展 1.1.1 烟草丛顶病发生及分布
烟草丛顶病最早发生在津巴布韦，以后在其邻国南非、马拉维、赞比亚等南部非洲国家，以及亚洲的巴基斯坦、泰国和中国的云南发现（Ndowora T，2002；杨程，2003；Blancard D et al，1999；顾刚等，1994）。1993年，烟草丛顶病首次在云南保山爆发，随后于1996年和1998年在云南金沙江、怒江、澜沧江三江流域烟区再度爆发，发病区域除涉及保山、大理、楚雄3个州市外，昆明、玉溪、红河、思茅、文山、西双版纳及怒江等州市也有烟草丛顶病零星发生（顾刚等，1994；李凡，1999；李凡等，2005）。
1.1.2 烟草丛顶病症状及传播途径
烟草丛顶病感病烟株叶色淡绿或黄化，并伴有系统坏死枯斑或坏死线纹，苗期感病烟株严重矮化、缩顶，叶片变小，而晚期感病的烟株腋芽过度增生，株型成为密生小叶、小枝的丛枝状塔型（李凡等，2005）。
烟草丛顶病可以通过汁液摩擦、菟丝子、嫁接及蚜虫传播，不经病土、病残体和种子等途径传染，摩擦接种发病的烟株不能再经蚜虫传播，自然条件下以蚜虫传播方式进行传毒（李凡等，2001；钱宁刚，2003；段玉琪等，2003）。
1.1.3 烟草丛顶病在中国的危害
1993年烟草丛顶病在云南保山发病面积达7300hm2，1996年和1998年在云南省金沙江、怒江、澜沧江三江流域烟区再度大规模流行，部分烟区造成毁灭性
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灾害。截至2001年，云南省累计发病面积达51300hm2，其中8700 hm2绝收，1400 hm2改种，直接经济损失高达2.1亿元，烟草丛顶病已成为云南省20世纪90年代以来唯一导致大面积绝产的烟草病害（李凡等，2005；秦西云，2005）。
1.1.4 烟草丛顶病病原物归属及其特征
烟草丛顶病由幽影病毒属（Umbravirus）的烟草丛顶病毒及黄症病毒科（Luteoviridae）马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）的烟草扭脉病毒（Tobacco vein distorting virus，TVDV）复合侵染引起（Gates et al，1962；李凡等，2002；Taliansky M E et al，2005；Darcy C J et al，2005）。烟草丛顶病是中国报道的唯一一个由幽影病毒属成员引起的病害，且目前在中国仅云南有发现（李凡等，2006）。
幽影病毒基因组不含编码外壳蛋白的基因，在感病植株体内不形成病毒的粒体结构（Taliansky M E et al，2003）。黄症病毒含有cp（coat protein）基因，其外壳蛋白具有异源包裹幽影病毒RNA的能力，形成可以被蚜虫传播的杂合病毒颗粒(Waterhouse P M et al，1983；Falk B W et al，1979；Murant A F，1990；李凡等，2006)。幽影病毒可以通过机械接种传播，自然条件下单独的幽影病毒不能通过蚜虫传播，但在其辅助病毒——黄症病毒外壳蛋白包裹下可以通过蚜虫传播（李凡等，2006）。
1.1.5 烟草丛顶病的综合防治
烟草丛顶病的综合防治采取“预防为主，治(避)虫防病”为中心的措施，以防治媒介昆虫、培育无毒烟苗和控制大田流行为主，其次从保健栽培及淘汰病苗方面入手，通过控制传播源、切断传播途径和增强烟株抗病性以达到有效防治病害的目的（杨程，2003；李凡等，2006）。
1.2 烟草丛顶病毒研究进展
1.2.1 烟草丛顶病毒国内外研究进展
国外除对烟草丛顶病的发生做报道外，仅限于症状学、传播途径和病原物寄主范围的描述，并未对烟草丛顶病毒进行深入研究（李凡等，2005），而国内对烟草丛顶病毒分子生物学进行了系统的研究。
2002年，Mo等人认为云南发生的烟草丛枝型病害在症状、传播方式、寄主范围等方面与津巴布韦发生的烟草丛顶病是同一种病害（Mo X H et al，2002）。其后李凡等人又对烟草丛顶病毒的复制酶（RNA-dependent RNA polymerase，
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RdRp）基因进行了克隆及测序，确定了烟草丛顶病毒是一类与幽影病毒属相关的病毒（李凡等，2002）。2003年，Mo等人通过cDNA克隆的方法，从TBTV的dsRNA1中得到了烟草丛顶病毒中国分离物（TBTV-Ch）基因组全长序列（Mo X H et al，2003）。2005年ICTV的第八次病毒分类报告，已将TBTV归为幽影病毒属的确定成员（Taliansky et al，2005）。2006年，王钰丽对与烟草丛顶病相关的dsRNA及卫星RNA开展了研究，说明了TBTV的类似卫星RNA不同分离物间的序列同源性与地理位置有一定的联系，TBTV的类似卫星RNA可能存在4个小的开放阅读框架（Open Reading Frame，ORF），其中ORF I会形成一个由44个核苷酸组成的稳定发卡结构（王钰丽，2006）。2008年，魏薇通过重叠延伸PCR法成功的扩增到TBTV云南大理巍山和保山龙陵两个分离物的全长基因组cDNA，并构建了TBTV的全长cDNA侵染性克隆（魏薇，2008）。2009年，龙亚芹完成了烟草丛顶病毒ORF3和ORF4的原核表达并对表达产物进行了其抗血清的制备（龙亚芹，2009）。
1.2.2 烟草丛顶病毒基因组结构
2003年，Mo等人获得了TBTV中国分离物的全基因组，基因组序列长4152个核苷酸，由4个ORF组成，分别为 ORF1、ORF2、ORF3及ORF4，它的5‘端和3‘端有长度分别为10个核苷酸和645个核苷酸的非翻译区（Mo X H et al，2003）。目前未见有关烟草丛顶病毒各个ORF基因功能研究的报道。
图1-1 TBTV的基因组结构（Mo et al，2003） Fig.1-1 Genome organization and structure of TBTV
1.3 基因功能研究方法
21世纪初当人类基因组计划完成，随后后基因组时代到来。后基因组学主要研究基因组的基因功能、基因之间的相互关系和调控机制。基因的功能研究有很多方法，按研究手段可分为比较分析与实验分析两类。比较分析基因功能的方法有生物信息学技术、基因芯片技术、蛋白质组学技术等；实验分析基因功能的方法有基因反义技术、RNAi技术、基因敲除技术、基因嵌入技术等。
生物信息学技术是通过对未知基因测序，并在美国的基因库(Gene Sequence Data Bank，GenBank)、基因组序列数据库(Gene Sequence Data Bank，GSDB)、
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欧洲的分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory，EMBL)和日本的DNA数据库(DNA Data Bank of Japan，DDBJ)中获得更多相似基因序列。再将这些序列通过序列分析比较工具(如BLASTn、BLASTx)进行比较分析，与基因序列资料中各类信息进行识别和比较，并得到序列之间的进化关系，初步确定基因序列结构和功能的关系（杜玉梅等，2008）。
生物芯片(biochip)是指芯片技术在生物学领域中应用的总称。该技术是20世纪90年代初半导体技术和生物技术的结合体，是通过缩微技术根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测（郭葆玉，2001）。以基因芯片技术(gene chips) 为例，基因芯片技术是利用核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的一种高新生物技术（李新枝等，2007）。基因芯片技术的原理是将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标签等)按横行纵列方式在固相支持物上有序点样。检测时，先用来自不同生理状态和发育阶段的mRNA作为模板，以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物反转录合成cDNA，再用所得cDNA与基因芯片进行杂交（杜玉梅等，2008；赵寿元，2001），通过计算机对其结果进行判读和处理，检测整个基因组范围的众多基因在mRNA表达水平丰度的变化，这样就可以知道芯片中哪些基因在细胞里表达，哪些基因不表达；同样也可以测知哪些基因的表达水平高，哪些基因的表达水平低，研究基因功能和表达调控的相关性，最终为研究基因的功能和基因遗传网络提供有力的证据（郭葆玉，2001）。
蛋白质组学技术是运用双向电泳、生物质谱、蛋白芯片、蛋白杂交、酵母双杂交系统、生物信息学等蛋白质组学的各种实验技术研究基因组所表达的全部蛋白质，鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等（Diane G，2005；蔡冬冬等，2009）。
以下重点介绍几种植物及其病原物基因功能研究方法。
1.3.1 基因反义技术
反义技术是根据碱基互补原理，利用人工或生物合成的特异互补的DNA或RNA片段(或其修饰产物)来抑制或封闭目的基因的表达。包括反义寡核苷酸技术(Antisense oligonuclerotides，ASON)、反义RNA技术和核酶(Ribozyme)技术（纪宗玲等，2002）。
1.3.1.1 反义寡核苷酸技术
反义寡核苷酸技术就是指人工合成能与DNA或RNA互补结合特异的寡核
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